Методом ВЭЖХ экстракты гуминовых кислот разделены на три фракции. Фракции 1 и 2 являются гидрофильными, фракция 3 содержат гидрофобные функциональные группы, в основном ароматического ряда, причем содержание этой фракции возрастает приблизительно в 3 раза для гуминовых кислот, выделенных из летнего образца вермикомпоста по сравнению с контролем, т. е. степень гумификации летнего образца более высокая.
Вероятно, одной из причин физиологической активности гуминовых кислот является наличие в их молекулах фрагментов, обладающих свойствами стабильных свободных радикалов, а их содержание, по-видимому, увеличивается с ростом степени гумификации субстратов.
Фульвокислоты являются водорастворимой частью гуминовых веществ и представляют собой высокомолекулярные азотсодержащие оксикарбоновые кислоты с эквивалентным весом около 300 а.е.м. (Ищенко А.В., 1999). От гуминовых кислот они отличаются более низкой молекулярной массой, более низким содержанием углерода, светлой окраской. Фульвокислоты растворяются в воде щелочных и кислых растворах, обладают склонностью к кислотному гидролизу.
Наибольшее количество фульвокислот проэкстрагировано из образца, не обработанного червями (контроль). Всего проэкстрагировано фульвокислот: из компоста (контроль) - 980 мг; из образца - зимний – 590 мг; образца - летний – 660 мг.
Анализ хроматографических данных экстрактов вермикомпостов (летний и зимний) выявил наличие 4 фракций фульвокислот. Фракции 1 и 2 сходны по составу, содержат более 70% вещества и, вероятно, наиболее богаты гидрофильными компонентами, этим объясняется лучшая растворимость фульвокислот при различных значениях рН. Содержание гидрофобных фракций 3 и 4 незначительно. Выделенные фракции экстрактов зимнего и летнего образцов вермикомпостов сходны по составу и одинаковому относительному содержанию в исследуемых образцах.
Хроматограмма контрольного образца существенно отличается от выше описанных. На хроматограмме контроля проявляются два дополнительных пика, что указывает на более сложный компонентный состав данного образца. Это обстоятельство может быть связано с гидротермическими и микробиологическими особенностями формирования фульвокислот под действием вермикультуры и без нее.
Для хроматографической характеристики фульвокислот разработан и применен метод ВЭЖХ в обращенных фазах, поскольку в литературе отсутствуют данные о характеристике фульвокислот, исследованных методом ВЭЖХ в обращеннофазовом режиме. Для получения интегральной хроматографической характеристики фульвокислот из экстрактов 1-8 были отобраны аликвоты по 1 мл и объединены, для 3-х образцов (летний, зимний, контроль) в отдельности.
При проведении хроматографического разделения фульвокислот получили 3 фракции. В первых двух преобладали гидрофильные фрагменты, третья содержала гидрофобные радикалы. Сравнительный анализ хроматограмм для исследованных образцов показал, что, полученные фракции, аналогичны по составу и относительному содержанию компонентов. Установлено возрастание содержания алифатических углеводородов и карбоксильных групп, содержание ароматических колец и полисахаридных фрагментов в фульвокислотах уменьшается с ростом степени гумификации.
Поскольку фульвокислоты обогащены кислородсодержащими фрагментами, то они имеют лучшую растворимость в воде и миграционную способность. Высокое содержание карбоксильных групп (до 27,1%) обусловливает кислотную агрессивность ФК по отношению к почвенным минералам и способность образовывать комплексные соединения с катионами железа, алюминия, меди и других металлов, переводя их в растворимые формы.
Высокая подвижность ФК, высокая поглотительная способность позволяют считать их важнейшим фактором, определяющим почвенное плодородие.
Оптимизация выделения гумусовых кислот. Ранее использовалась стандартная процедура экстракции гумусовых кислот, рекомендуемая IHSS (Swift R.S., 1999)
Ее использование позволяло извлечь максимальное количество экстрагируемых веществ, однако эта методика включает 11 процедур экстракции по 24 часа для извлечения гумусовых кислот (гуминовые кислоты и фульвокислоты) и столько же процедур по 20 часов для разделения гуминовых и фульвокислот. Используя данные по полноте экстракции гуминовых кислот по ранее используемой методике, оптимизирован одноступенчатый метод выделения гумусовых кислот. В таблице 4 приведены данные по экстрагируемости гумусовых кислот. Из таблицы видно, что при соотношении 1/100 из образцов практически извлекается такое же количество гумусовых кислот как и при 11 экстракциях. На этом основании в дальнейших работах можно использовать для извлечения гумусовых кислот только одну экстракцию при соотношении биогумус (компост)/экстрагент (0,1 N NaOH; pH 12,5), время экстракции 24 часа.
Таблица 4 Экстрагируемость гумусовых кислот из компоста и биогумуса в зависимости от соотношения масса биогумуса (компоста)/ объем экстрагента
| Наименование образца | Экстрагируемость гумусовых кислот, г (%) | ||
| Проведение 11 экстракций при соотношении 1/10 | Проведение 1 экстракции при соотношении 1/50 | Проведение 1 экстракции при соотношении 1/100 | |
| контроль | 2,08 | 1,12 | 1,95 |
| зимний | 1,42 | 0,56 | 1,51 |
| летний | 1,56 | 0,86 | 1,49 |
Гиматомелановые кислоты — группа гумусовых кислот, растворимых в этаноле. Выделяются из свежеосажденной гуминовой кислоты раствором этилового спирта. В растворе имеют вишнёво-красный цвет.
Для сравнительного физико-химического анализа гиматомелановых кислот компостов и вермикомпостов их выделяли из сухих препаратов гумусовых кислот, полученных по выше приведенной оптимизированной методике.
В таблице 5 приведены данные по экстагируемости гиматомелановых кислот различными спиртами.
Таблица 5 Экстрагируемость гиматомелановых кислот различными спиртами
| Наименование образца | Экстрагируемость спиртами, мг/г (%) | ||
| метанол | этанол | Пропанол | |
| контроль | 155 (15,5) | 200 (20,0) | 75 (7,5) |
| зимний | 183 (18,3) | 215 (21,5) | 85 (8,5) |
| летний | 155 (15,5) | 233 (23,3) | 60 (6,0) |
Из таблицы 5 видно, что максимальное весовое количество гиматомелановых кислот экстрагируется этанолом (от 20 до 23%).
Хроматограммы для исследованных образцов гиматомелановых кислот существенно отличаются друг от друга, как количеством пиков, так и интенсивностью поглощения. Для сравнения хроматографических данных были использованы интегральные характеристики пиков, а именно суммарные площади под пиками хроматограмм.
В таблице 6 приведены хроматографические данные по суммарным площадям под пиками хроматограмм при детектировании 220 и 280 нм, а также данные по относительной ароматичности препаратов из 3-х исследованных образцов (контроль, зимний, летний).
Из таблицы 6 видно, что при экстракции метанолом и этанолом уменьшаются площади под пиками хроматограмм в следующем ряду: контроль > образец-зимний > образец-летний, как при детектировании 220 нм, так и - 280 нм, что свидетельствует об уменьшении содержания как карбоксильных и карбонильных групп, так и фенольных групп в гиматомелановых кислотах. В то же время, соотношение ∑S 280/∑S 220 остается практически неизменным.
Последний факт свидетельствует о приблизительно одинаковой относительной ароматичности исследованных образцов гиматомелановых кислот, или другими словами, возрастание степени гумификации гуминовых кислот разного срока созревания не связано с изменением относительной степени ароматичности гиматомелановых кислот.
При экстракции пропанолом экстрагируемость гиматомелановых кислот приблизительно в 2- 3 раза ниже, чем при экстракции метанолом или этанолом (табл. 6).
Таблица 6 Хроматографические данные гиматомелановых кислот при экстракции различными спиртами
| Наименование образцов | Используемые спирты | ||||||||
| метанол | этанол | Пропанол | |||||||
| ∑S280 | ∑S 220 | ∑S 280/∑S 220 | ∑S 280 | D220 | ∑S 280/∑S 220 | ∑S 280 | ∑S 220 | ∑S 280/∑S 220 | |
| контроль | 655 | 4674 | 0,14 | 863 | 5826 | 0,15 | 632 | 5880 | 0,11 |
| зимний | 150 | 917 | 0,16 | 328 | 3340 | 0,10 | 2235 | 2716 | 0,82 |
| летний | 135 | 895 | 0,15 | 296 | 2302 | 0,13 | 1085 | 2293 | 0,47 |
Гуминовые кислоты и фульвокислоты, выделенные из компостов и вермикомпостов различного происхождения, анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В ходе эксперимента были использованы следующие компосты и вермикомпосты: конский, птичий, свиной, осадок сточных вод. Вермикомпосты получены в течение 6 месяцев с мая по октябрь 2004 года.