Влияние вакуумного ультрафиолета на гемоглобин (стр. 3 из 4)

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Цель и задачи исследования

Целью данной работы явилось изучение закономерностей фотопревращений гемоглобина человека после воздействия ВУФ-излучения на молекулы этого транспортного белка крови.

Задачи исследования:

1) изучение методик приготовления тонких плёнок белка (~ 0,1мкм);

2) облучение тонких плёнок светом аргоновой лампы барьерного разряда в диапазоне длин волн 118-134 нм (λmax=126 нм);

3) изучение оптических свойств молекул гемоглобина человека, подвергшихся ВУФ-облучению в дозе 1,8 кДж/м².

2.2. Объект и методы исследования

2.2.1. Объект исследования

Объектом исследования стал гемоглобин человека (в концентрациях 10

-10

моль/л). Оксигемоглобин выделяли по методу, описанному Драбкиным Оксигемоглобин выделяли по методу, описанному Драбкиным (D.L. Drabkin, 1946) с модификациями Блюменфельда (Л.А. Блюменфельд, 1957). . В основе этого метода лежит явление гемолиза эритроцитов под действием воды.

2.2.2. Методика приготовления тонких пленок гемоглобина

Для получения тонкой пленки супернатант с концентрацией белка 10

-10

моль/л в объеме 10 мкл наносили на подложку из фтористого магния (d=30мм, толщина 1 мм(А.Н. Зайдель, Е.Я. Шрейдер, 1967)) и механически равномерно распределяли по всей её поверхности, затемоставляли до полного высыхания в суховоздушном термостате при t=37,00±0,01ºCв течение 60 мин. Толщина пленок белка, измеренная при помощи интерференционного микроскопа МИИ – 4 «Ломо» Россия, составляет 0,1 мкм составляла порядка 0,1 мкм.

Выбор фтористого магния в качестве материала дл нанесения образцов обусловлен широким интервалом спектрального пропускания от 0,113 до 9 мкм, что позволяет использовать их для изучения спектрофотометрическим методом структурных изменений молекул во всем оптическом диапазоне (Л.П. Шишацкая и др., 1988). Кристаллы фтористого магния более стойки, чем, например фтористый литий, к радиационному разрушению, тепловым механическим ударам, и, кроме того они не гигроскопичны.

2.2.3. Методика облучения тонких пленок белка

Полученные пленки белка облучали светом аргоновой лампы барьерного разряда в диапазоне длин волн 118-134 нм (λmax=126 нм) при помощи установки, собранной на кафедре биофизики и биотехнологии ВГУ. Указанная установка состоит из источника питания лампы, источника ВУФ-облучения, на который помещали подложку с нанесенным на нее образцом.

2.2.4. Регистрация спектров поглощения белковых образцов в видимой области

Измерение спектров поглощения пленок белка проводили на спектрофотометре СФ-46 в области длин волн 405, 413, 500, 542, 560, 576 и 630 нм. Контролем служила подложка из фтористого магния без образца.

2.3. Полученные результаты и их обсуждение

Поглощение энергии ВУФ-излучения в области 118-134 нм хромофорами карбоксильных групп белковых молекул сопровождается возбуждением молекул и переходом электронов на более высокий энергетический уровень (рис. 2). Эти изменения находят отражение в электронных спектрах поглощения белковых молекул, регистрация которых является одним из чувствительных методов измерения изменений состояния белка.

Таким образом, анализ спектральных характеристик белковых образцов позволяет получить надежную информацию о состоянии белковых молекул при действии вакуумного ультрафиолетового излучения.

При облучении пленок гембелка светом аргоновой лампы барьерного разряда в дозе 1,8 кДж/м² нами не зарегистрировано достоверного изменении структурного состояния гембелка. ВУФ- излучение в области светопоглощения хромофорами карбоксильных групп гембелка (120 нм) не вызывает достоверных изменений структурного состояния гемоглобина человека.

Уровень ионизации ·АН

+е

А·+Н

1 3

Рис.2. Схема одноквантового возбуждения белковых молекул

Таблица 2

Соотношение полос поглощения молекул гемоглобина

человека после ВУФ-облучения пленок

Доза облучения,

кДж/м²

413/405

n=6

500/542

n=6

542/560

n=6

1,05±0,32

0,94±0,27

0,97±0,15

1,8

1,22±0,22

0,92±0,23

1,05±0,13

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

На основании проведенных экспериментов нами были сделаны следующие выводы:

При ВУФ-облучении (118 – 134 нм) молекул оксигемоглобина человека в пленках в дозе 1,8 кДж·м² нами не зарегистрировано достоверного изменения структурного состояния гембелка.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Артюхов В.Г. Олигомерные белки: структурно-функциональные модификации и роль субъединичных контактов / В.Г. Артюхов, О.В. Башарина, Г.А. Вашанов и др. – Воронеж: Изд-во ВГУ, 1997. – 261 с.

2. Артюхов В.Г. Оптические методы исследования биологических систем и объектов / В.Г. Артюхов, М.С. Бутурлакин, В.П. Шмелев. - Воронеж, 1980. – 116 с.

3. Акопян М.Е. Масс-спектрометрические исследования фотоионизации свободных α-аминокислот / М.Е. Акопян, Ю.В. Логинов // Химия высоких энергий. – 1967. Т. 1, вып. 2. – С. 97 – 102.

4. Практикум по биофизике / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина, С.Г. Резван и др. – Воронеж, Изд-во ВГУ, 2001. – 223 с.

5. Блюменфельд Л.А. Гемоглобин и обратимое присоединение кислорода / Л.А. Блюменфельд. – Москва: Сов. Наука, 1957. – 140 с.

6. Вейсблут М. Физика гемоглобина. Структура и связь / М. Вейсблут. – Москва: Моск. Кн. Изд-во, 1969. – С. 11 – 76.

7. Веркин Б.И. Источники вакуумного ультрафиолетового излучения / Б.И. Веркин, Э.Т Верховцева, Я.М. Фогель // Физика вакуумного ультрафиолетового излучения. – Киев, 1974. – С. 38 – 58.

8. Виноградов И.П. Спектры поглощения алифатических аминокислот и простых пептидов в вакуумной ультрафиолетовой области спектра / И.П. Виноградов, Н.Я. Додонова // Опт. И спектр. – 1971. – Т. 30, вып. 1. – С. 27 – 31.

9. Виноградов И.П. Спектрально люминесцентные исследования ароматических аминокислот в вакуумной ультрафиолетовой области спектра 90 К / И.П. Виноградов, Н.Я. Додонова // Биофизика. – 1971. – Т. 16, вып. 2. – С. 343 – 345.

10. Виноградов И.П. Спектрально люминесцентные исследования белков в вакуумной ультрафиолетовой области спектра при 72 К / И.П. Виноградов, Н.Я. Додонова // Опт. И спектр. – 1971. – Т. 30, вып. 5. – С. 868 – 871.

11. Dodonova N.Ya., Kiseleva M.N., Remisova L.A., Tsiganenko N.M. The vacuum ultraviolet photochemistry of nucleotides // Potocem. Potobiol. – 1982. - V.35. - P. 129 – 132.

12. Додонова Н.Я., Киселева М.Н., Петров М.Ю., Цыганенко Н.М., Чихиржина Г.И. Спектральные исследования хроматина и его компонентов в вакуумной ультрафиолетовой области спектра // Биофизика. – 1984. –Т. 24, вып.6. – С. 961 – 965.

13. Додонова Н.Я., Цыганенко Н.М., Кузичева Е.А., Симаков М.Б. Абиогенный синтез уридиновых нуклеотидов под действием вакуумного ультрафиолетового излучения // Биофизика. – 1994. – Т. 39, вып. 1. – С. 26 – 31.

14. Drabkin D.L. Spektrophotometer studies. // The crystallographic and optical properties of the hemoglobin of man in comparison with those of other species // Biol. Chem. – 1946. – V. 164, no. 2. – P. 703 – 723.

15. Зайдель А.Н., Шрейдер Е.Я. Спектроскопия вакуумного ультрафиолета. – Москва: Изд-во Наука, 1967. – 470 с.

16. Киселева М.Н., Цыганенко Н.М., Смирнова Т.М., Додонова Н.Я. Фотолиз тотального гистона и ДНК плазмиды pBR-322 в вакуумной ультрафиолетовой области спектра // Биофизика. – 1989. – Т. 34, вып. 4. – С. 536 – 540.

17. Киселева М.Н., Додонова Н.Я. Люминесценция нуклеогистона, возбуждаемая в области спектра 120 – 350 нм // Биофизика. – 1993. – Т. 38, вып. 3. – С. 421 – 427.

18. Манойлов Ю.С. Изменение физических свойств гемопротеидов при действии ионизирующего излучения / Ю.С. Манойлов // Проблемы энергетики в облученном организме. – Москва, 1977. С. 10 – 96.

19. Megumi T., Nishikawa R., Fujita S., Saito M., Ito T. Absorption spectra of viral components of Sendai virus in the wavelength region from 130 to 320 nm // Photochem. Photobiol. – 1991/ - V/ 10, no. 1-2. P. 79 -89.

20. Munakata N., Saito M., Heida K. Inactivation action spectra of Bacillus subtilis spores in extended ultraviolet wavelengths (50 – 300 nm) obtained with synchrotron radiation // Potochem. Potobiol. – 1991. - V. 54, no 5. – P.761 – 768.

21. Сухов Д.А., Додонова Н.Я., Вилесов Ф.И. Исследование фотоэмиссии нуклеиновых кислот и родственных им соединений в области 120 – 250 нм // Биофизика. – 1976. Т. 21, вып. 5. – С. 817 – 819.