Взаимодействие низкомолекуляных соединений с мембранами (стр. 6 из 8)

1.Одновалентные ионы, например натрий, действительно свя-зываюется с кислыми фосфолипидами, но с низким сродством.

2.Истинное сродство Са²⁺ к поверхности цвиттерионных фосфолипидных везикул близко или чуть меньше, чем к поверхности кислых фосфолипидов. Более сильное связывание Са²⁺ с кислыми фосфолипидами обусловлено не ббльшим сродством к ним Са²⁺, а скорее всего электростатическим эффектом более высокой плотности отрицательных зарядов, приводящим к возрастанию локальной концентрации Са²⁺ на поверхности.

3.Связывание как одно-, так и двухвалентных катионов, по-видимому, почти не влияет на конформацию полярных головок фосфолипидов, по крайней мере для фосфатидилхолина и фосфатидилглицерола. При связывании с фосфатидилсерином наблюдается иммобилизация карбоксильных групп.

4.Обычно Са²⁺ связывается с фосфолипидами в стехиометрии 1:1, хотя в случае фосфатидилхолина один ион Са²⁺ связывается с двумя молекулами липида. По-видимому, образуется и комплекс со стехиометрией 1:2, когда в результате связывания металла происходит агрегация мембран; при этом двухвалентный катион может служить мостиком между двумя плотно прижатыми поверхностями мембраны.

5.Связывание Са²⁺ может приводить к изменению физического состояния липида. Например, связывание Са²⁺ с фосфатидилсерином или фосфатидной кислотой может сопровождаться переходом бислоя в фазу геля, а при взаимодействии с кар-диолипином стабилизируется гексагональная фаза. Если везикулы состоят из смеси кислых и цвиттерионных липидов, то связывание с Са²⁺ вызывает латеральное разделение фаз; при этом могут образовываться обширные домены в однослойных везикулах.

6.Свои преимущества дает связывание фосфолипидов с Мп²⁺, поскольку этот парамагнитный ион изменяет спектр ³¹Р-ЯМР. Эти изменения зависят от локальной концентрации Мп²⁺ и, следовательно, могут использоваться для измерения поверхностного потенциала.

7.С поверхностью кислых бислоев прочно связываются также поликатионы, например поли- или гентамицин.

Дзета-потенциал и электрокинетические явления

Если заряженные везикулы поместить в электрическое поле, то они будут перемещаться по направлению к электроду, заряд которого противоположен по знаку заряду везикул. Электрофоретиче-ская подвижность везикул определяется так называемым дзета-потеициалом, который равен электрическому потенциалу между объемом раствора и так называемой плоскостью Гельмгольца, параллельной плоскости мембраны. Эта плоскость отделяет плотную часть двойного электрического слоя, которая перемещается в электрическом поле вместе с мембраной и находится на расстоянии около 2 А от заряженной поверхности везикулы. Таким образом, величина дзета-потенциала меньше, чем величина поверхностного потенциала, и связана с поверхностным потенциалом соотношением, определяемым теорией Гюи—-Чапмена. Измерение дзета-потенциала лежит в основе одного из стандартных методов оценки поверхностного потенциала и может использоваться для изучения связывания ионов с поверхностью фосфолипидных везнкул. На электрофоретическую подвижность влияет также наличие выступающих над поверхностью бислоя заряженных нели-пидных мембранных компонентов, например белков или ганглиози-дов, и с помощью электрокинетических методов можно получить определенную информацию о распределении зарядов вблизи поверхности везикул.

Связывание гидрофобных ионов и мембранных зондов

Наличие поверхностного потенциала может повлиять на связывание с поверхностью мембраны гидрофобных ионов и амфифиль-ных мембранных зондов. Это позволяет использовать некоторые зонды в качестве индикаторов поверхностного потенциала. На рис. 7.9 приведены структурные формулы некоторых зондов. Для всех этих соединений интенсивность спектрального сигнала можно соотнести с количеством связанного с мембраной зонда и, следовательно, с величиной поверхностного потенциала. Такие зонды применяли для изучения многих заряженных фосфолипидных везикул

Исследование с их помощью биомембран более проблематично, поскольку спектральные характеристики зонда могут зависеть не только от поверхностного потенциала, но и от рН или трансмембранного потенциала, что сильно затрудняет интерпретацию наблюдаемых спектральных изменений. В качестве примера можно привести связывание с митохондриями АНС и изменение спектральных характеристик нейтрального красного при связывании с субмитохондриальными частицами.

На рис. 7.10, А представлен профиль электрического потенциала для мембраны, обе поверхности которой отрицательно заряжены. При наличии на мембране поверхностного потенциала увеличивается концентрация в этой мембране таких гидрофобных катионов, как ТФФ⁺ или комплекс К ⁺-валиномицин. Это связано с тем, что локальная концентрация ионов вблизи поверхности мембраны больше, чем их концентрация в объеме. Напомним, что коэффициент проницаемости может быть представлен в виде произведения коэффициента распределения /3 на константу скорости перемещения иона через мембрану к, поэтому из-за большой величины /3 проницаемость отрицательно заряженной мембраны для гидрофобных катионов будет выше, чем незаряженной. Зависимость проводимости мембраны от поверхностного заряда удовлетворительно описывается уравнением Гюи—Чапмена для поверхностного потенциала.

Заметим, что потенциал внутренних диполей может влиять как на связывание гидрофобных ионов с поверхностью бислоя, так и на константы скорости трансмембранного транспорта, в то время как эффект симметричного поверхностного потенциала на проницаемость обусловлен исключительно его влиянием на коэффициент распределения. В случае асимметричного распределения поверхностных зарядов ситуация усложняется. Подобное асимметричное распределение липидов — явление отнюдь не редкое. В этом случае существующий на мембране градиент потенциала будет затруднять перенос катионов из водной фазы 1 в фазу 2 и облегчать перенос катионов в противоположном направлении.

4. Трансмембранный потенциал

Трансмембранный потенциал по определению есть разность электрических потенциалов между двумя водными фазами, разделенными мембраной. Связь между трансмембранным потенциалом и поверхностными потенциалами *i и ♦г графически представлена на рис. 7.10, А Из схемы видно, что разность потенциалов между двумя поверхностями мембраны ДФ может отличаться от Д* из-за асимметричного распределения заряда между двумя поверхностями бислоя. Любая находящаяся внутри мембраны заряженная группа будет перемещаться в поле с потенциалом ДФ. Д* называют также потенциалом покоя, и именно эту величину, если удается, измеряют парой электродов.

Создать трансмембранный потенциал можно несколькими способами. Схематически они изображены на рис. 7.11.

1. Равновесные условия. Если мембрана проницаема для какого-то определенного иона, например Na⁺, и непроницаема для других, то на ней может возникнуть диффузионный потенциал, пропорциональный логарифму отношения концентраций проникающего иона по одну и другую стороны мембраны. Диффузия иона через мембрану сопровождается трансмембранным разделением зарядов, и создаваемая при этом разность потенциалов препятствует дальнейшей диффузии. Заряд, который нужно переместить через мембрану для создания на ней данного значения Aif, можно вычислить исходя из емкости мембраны. Для создания Д* = 100 мВ нужно перенести примерно один заряд на 250 молекул фосфолипида. Ясно, что поверхностная плотность заряда при этом изменится крайне незначительно.

В равновесии Д* определяется уравнением Нернста:

Это же уравнение следует использовать в случае переноса иона с валентностью Z. Проницаемость биомембран для ионов связана с работой специфических ионных каналов. Ее можно искусственно увеличить с помощью специфических переносчиков ионов или ионофоров, например К ⁺ -вали-номицина.

2.Стационарный диффузионный ионный ток. Если мембрана проницаема дял нескольких ионов, то все они будут перемещаться через нее. При этом в стационарных условиях из-за различий в коэффициентах проницаемости для разных ионов может возникнуть трансмембранная разность потенциалов. Иными словами, разделение зарядов на мембране в такой ситуации будет связано с тем, что одни ионы диффундируют через мембрану быстрее других. Уравнение, описывающее данную ситуацию, называется уравнением Гольдмана—Ходжкина—Каца и для случая двух ионов имеет следующий вид:

Перемещение ионов будет продолжаться до тех пор, пока не установится равновесие.

3.Активный перенос ионов. Трансмембранное разделение зарядов может происходить и с помощью процессов активного транспорта. Многие ферменты катализируют реакции, сопряженные с векторным переносом зарядов через бислой. В качестве примеров можно привести разнообразные АТР-зависимые ионные насосы, например Са²⁺ -АТРазу или цитохром с-оксидазу, представляющую собой протонный насос. Здесь мы отметим лишь, что катализируемые этими ферментами реакции являются электрогенными, т. е. сопровождаются переносом зарядов через бислой. Очевидно, в такой системе должен существовать какой-то трансмембранный нейтрализующий ионный поток. В системе, представленной на рис. 7.11, таким потоком является пассивный контртранспорт ионов CI ~, возникающий при работе протонного насоса. Как и в случае пассивных ионных потоков, скорость потока противоионов будет меньше, чем скорость активного процесса, и в результате суммарный поток ионов через бислой не будет электронейтральным и на мембране возникнет разность потенциалов №. Если проницаемость бислоя для нейтрализующих ионов сделать достаточно большой, то разделения зарядов уже не будет. На этом принципе основано использование ионофоров для устранения трансмембранного электрического потенциала, создаваемого как на биологических мембранах, так и в модельных системах.