Хімічна біотехнологія (стр. 3 из 5)

Лимонна кислота. У цієї кислоти приємний смак і її широко використовують в харчовій, фармацевтичній і косметичній промисловості. Оскільки ця речовина зв’язує метали, її використовують для їх очистки.

Процес виробництва лимонної кислоти проходить за допомогою ферментації при участі грибів. Налагоджено його вперше в 1843 році. Основні проблеми цього процесу спочатку були зв’язані з мікробним забрудненням. Виявилось, що процес можна вести при низьких рН і в таких умовах утримувати стерильність простіше. За 1-2 тижні при високих концентраціях цукру, вихід лимонної кислоти становив 60 %. В 1950 році було освоєно глибинне культивування. Відомо, що стабільний процес глибинної ферментації можливий лише в тому випадку, якщо він здійснюється у дві стадії: на першій йде ріст міцелію, а на другій – утворення лимонної кислоти. Для цього процесу використовується сировина: меляса, крохмаль, глюкозний сироп.

Наявність іонів металів в вихідному середовищі приводить до різкого падіння виходу лимонної кислоти. Їх осаджують за допомогою гексаціаноферату, пропусканням через іонообмінні смоли, а також для ліквідації їх шкідливої дії цих домішок використовують метанол і інші спирти. В 60-х роках були запропоновані процеси для виробництва лимонної кислоти за допомогою штамів Corynebacterium, Arthrobacter, Brevibacterium, Candida.

В промисловому виробництві в основному використовують Aspergillusniger, A. wentii. Надлишок продукції лимонної кислоти являється реакцією відповіді на недостачу фосфату, але при вираженій нестачі металів, лімітуючим фактором не обов’язково являється фосфат. Оптимум рН складає 1,7-2,0. В більш лужному середовищі проходить утворення помітних кількостей щавлевої та глюконової кислот. Таким чином, контроль за культуральним середовищем дозволяє обійти регуляторні системи обміну і створює оптимальний фон для утворення лимонної кислоти. Очевидно в цих умовах стимулюється гліколіз і забезпечується необмежене надходження вуглецю в реакції проміжного метаболізму.

В промисловому виробництві лимонної кислоти застосовується декілька варіантів процесу. Традиційним твердофазним варіантом являється процес Коджі. Він має багато спільного з поверхневою ферментацією. Глибинна ферментація є періодичною і безперервною. Безперервна дає найбільший вихід продукції, але його застосування в промисловості поки, що малоймовірно.

На першому етапі утворюється значна кількість продукту. На другому етапі ріст відсутній, а гранична кількість продукту залежить від концентрації біомаси. В кінці ферментації масу міцелію відокремлюють фільтруванням і промивають. Потім при рН<3,0 осаджують щавлеву кислоту в формі оксалату кальцію. Лимонну кислоту осаджують із рідкої фази в формі кальцієвої трьох заміщеної солі в комплексі з чотирма молекулами води. Осад відфільтровують, промивають і вільну кислоту отримують шляхом обробки сульфатом кальцію. Далі її очищають за допомогою активованого вугілля і іонообмінних смол. Можна також екстрагувати кислоту розчинником. (Бест Д., Химия и биотехнология. В кн.Биотехнология.)

Розроблений ряд процесів добування інших органічних кислот – глюконової, яблучної, виннокам’яної, саліцилової, янтарної, піровиноградної, коєвої. В сьогоднішніх умовах здебільшого, їх виробництво не вигідно економічно. D-глюконову кислоту добувають з глюкози за участю Aspergillusniger. В деяких країнах сходу для її виробництва використовують чайний гриб. Натрієва сіль глюконової кислоти використовується для вилучення металів. Оскільки в присутності їдкого натру вона може зв’язувати кальцій, то використовується в складі лужних препаратів для миття посуду. Кальцієві і залізовмісні солі глюконової кислоти застосовуються як пероральні і внутрівенні препарати в медицині, а чиста кислота – як миючий засіб в молочній промисловості.

Виннокам’яна кислота являється звичайно побічним продуктом виноробства. Її можливо дістати і шляхом мікробної трансформації 5-оксиглюконової кислоти. Штами, які здатні перетворювати глюкозу в 5-оксиглюконат через глюконат, можуть шляхом подальшої ферментації утворювати тартат. Для цього використовують мутанти AcetobacteriGluconobacter. Солі винної кислоти (тартати) знаходять застосування в харчовій промисловості, але методи біотехнології в її виробництві звичайно не використовуються.

Яблучну кислоту можна добувати з фумарової в харчовій промисловості за допомогою Paracolobactrum. Також можна її отримувати з н-парафінів за допомогою дріжджів і з етанолу за участю Schisophyllum commune.

Знафталіну за допомогою бактерій можливо синтезувати саліцилову кислоту і інші його похідні. Більшість диких штамів бактерій (Pseudomonas. Corynebacterium і ін.) які розщеплюють нафталін, рідко виробляють саліцилат в концентрації більшій за 1%. Але шляхом відбору штамів і зміни середовищ можна збільшити вихід цієї речовини. Для збільшення виходу саліцилової кислоти необхідні іони різних металів. Відомо також, що ферментація регулюється продуктом, що накопичується, тобто видалення саліцилату з середовища приводить до подальшого утворення його бактеріями.

3.Синтез амінокислот за допомогою біотехнологій і їх застосування.

Всі амінокислоти, з яких складаються білки, являються L-α-амінокислотами.

Вони знаходять застосування як харчові добавки, приправи, посилювачі смаку, як сировина в парфумерній та фармацевтичній промисловості.

Їх можна добувати з інших природних продуктів, головним чином при гідролізі білків рослин, так і шляхом хімічного мікробіологічного або ферментативного синтезу. Якщо хімічний синтез дає продукт-рацемат, який потребує дальшої обробки, то останні два дають можливість оптично чисті амінокислоти. В цьому і полягає перевага біотехнологічних методів над хімічними.

Особливістю більшості виробничих процесів за участі мікроорганізмів, являється зміна умов середовища. За рахунок цього досягається синтез надлишкової кількості бажаного продукту. В основному для цього змінюють рН розчину, концентрацію продукту, концентрацію субстрату або шляхом встановлення критичних рівнів домішок (іонів металів, органічних домішок) в середовищі.

Бактерії для виробництва амінокислот стали застосовуватись з початку 50-х років 20 ст. Утворювати амінокислоти здатні бактерії багатьох родів, наприклад Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Escherichia, Aerobacter. Вони настільки продуктивні, що виробництво є рентабельним, що в наш час дуже важливо. Corynebacterium або Brevibacterium, які вирощують на вуглеводному середовищі, ацетаті, етанолі, при наявності певної кількості біотину, здатні синтезувати до 30 грам на літр глутамату.

Різними методами впливу можливо змінювати вихід амінокислот. Наприклад, шляхом зміни умов середовища, процес ферментації, у ході якого утворюється L-глутамат, може бути переключений на синтез L-глутамiну або L-проліну. При високій концентрації біотину та іонів амонію складаються сприятливі умови для створення L-проліну, а при більшій концентрації іонів цинку і амонію в слабо кислому середовищі посилюється синтез L-глутаміну. Для регуляції синтезу АК можна використовувати ауксотрофні мутанти багатьох штамів.

Цікавим і дуже ефективним є утворення амінокислот з використанням іммобілізованих в поліакріламідний (ПААГ) гель мікроорганізмів. Клітини кишкової палички, іммобілізовані в ПААГ можуть здійснювати перетворення фумарової кислоти в аспарагінову.

HOOC–CH=CH–COOH + NH₃ HOOC–CH–CH₂–COOH

NH₂

Фумарова кислота L-аспарагінова кислота

Активність іммобілізованих клітин зберігалась при підвищеній температурі (37єС) в присутності іонів магнію (Mg²⁺) на протязі 40 днів при швидкості протікання через колонку об’ємом 10·100 см 0,5 мілілітрів за годину, причому вихід аспартату становив 95% з 1 М розчину фумарової кислоти. При використанні такої колонки в промисловості щоденний вихід кислоти був 1900 кг, або 57,5 т на місяць. Інший приклад промислового застосування мікроорганізмів для біоконверсії органічних сполук – це добування L-яблучної кислоти за допомогою іммобілізованих клітин Brevibacteriumflavum. (Біотехнологія. А. Баев)

Синтез амінокислот за допомогою ферментів.

Процеси застосування ферментів при синтезі АК бувають одно- і багатостадійними, а методи, які використовуються, різноманітними. В залежності від цього виділяють 5 класів ферментів:

1. Гідролітичні ферменти (гідролази). Наприклад 2-аміно-тіазолін-4-карбоксигідролаза яка відповідає за синтез L-цистеїну (рис2.), або L-α-аміно-ε-капролактам-ліаза, яка відповідає за синтез L-лізину. Для використання неочищених ферментів, цілі клітини обробляють поверхнево-активними речовинами, що викликають зміни проникності і можуть використовувати мутантні штами, в яких продукт не використовується в обміні речовин.

Рис.2. Застосування гідролітичних ферментів для виробництва цистеїну

2. Ліази. Відповідають за реакції дезамінування. Для утворення L-аспартату із фумарату амонію може використовуватись аспартаза або L-аспартат–аміак-ліаза. В якості донорів амонію, крім цього, може виступати гідразин або гідроксиламін.