Биогенез мембран (стр. 9 из 11)

жить, что другой рецептор сигнальной последовательности находится во внутренней мембране.

8. СБОРКА МУЛЬТИСУБЪЕДИНИЧНЫХ КОМПЛЕКСОВ И ОБНОВЛЕНИЕ МЕМБРАННЫЗ БЕЛКОВ

После встраивания мембранного полипептида в мембрану он еще должен приобрести правильную конформацию, обеспечивающую его биологическую активность, а если речь идет о мультнсубъ-единичных комплексах, то связаться с другими белками. В частности, у эукариот при этом должны произойти различные ковалент-ные модификации, например гликозилирование, ацилирование, сульфирование или образование днсульфидных связей. Даже когда такие модификации не являются необходимыми, процесс конформацион-ного созревания может быть медленным и отстоять по времени от встраивания в мембрану.

Например, у Е. coli четко наблюдается сборка стабильных три-меров обоих белков, LamB и OmpF, после включения соответствующих мономеров в наружную мембрану, при этом созревание LamB занимает около 5 мин. В эукариотнческих клетках гли-копротеин гемагглютннииа вируса гриппа, прежде чем попасть из эндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи, должен сформировать правильную четвертичную структуру, соответствующую зрелой форме. Несвериутые молекулы гемагглютинина остаются в эндоплазматическом ретикулуме. Образование тримеров занимает примерно 7—10 мии. Сходная олигомеризация наблюдается также для G-белка вируса везикулярного стоматита.

Сборка многих мультисубъединичных комплексов, содержащих разные субъединицы, тоже, по-видимому, происходит в эндоплазматическом ретикулуме. Примером служит никотиновый ацетилхо-линовый рецептор, который содержит две а-субъединицы и по одной /3-, у- и б-субъединице. С помощью антител можно различить отдельные формы а-субъединицы: 1) начальный продукт, встраивающийся в эндоплазматический ретикулум; эта форма не может связывать антагонист а-бунгаротоксин; 2) форма, способная связываться с а-бунгаротоксином и образующаяся через несколько минут после завершения трансляции в эндоплазматическом ретикулуме; 3) зрелый рецептор, содержащий все субъединицы, который обнаруживается через 15 мин после завершения трансляции в эндоплазматическом ретикулуме; 4) готовый рецептор на клеточной поверхности, появляющийся спустя примерно 2 ч после трансляции. Созревание включает образование днсульфидных связей, олигосахаридный процессинг и ацилирование при участии жирных кислот. Вероятно, определенную роль в сборке, происходящей в комплексе Гольджи, играет фосфорилирование субъединиц.

Решающим фактором процесса сборки является, вероятно, стабильность таких стехиометрических комплексов, как ацетилхолино-вый рецептор. По-видимому, в некоторых системах отдельные субъединицы синтезируются в значительном избытке и не образуют стабильных комплексов, а подвергаются протеолитическому расщеплению. Об этом свидетельствуют результаты, полученные при изучении некоторых мультисубъедииичных комплексов, в частности Т-клеточного рецептора антигена.

Изучался также процесс созревания и сборки структуры, образующей Na-канал. Необходимым условием созревания является образование дисульфидной связи между а- и /Зг-субъединицами, однако это событие происходит спустя примерно 1 ч после трансляции и транспорта субъединиц в аппарат Гольджи, а рецептор появляется на клеточной поверхности чере:> 4 ч после трансляции. В этом случае свободные а-субъединнцы не подвергаются быстрой деградации, а сохраняются в межклеточном пуле и, возможно, используются в дальнейшем в качестве предшественников для формирования канала в растущих нейронах.

Созревшие мембранные белки подвергаются непрерывному обновлению. Период полуобновления Na-канала составляет около 30 ч, что типично для поверхностных белков. Обновление большой субъединицы Na/K-АТРазы в растущих клетках в культуре происходит за время 20 — 40 ч. По-видимому, деградация по крайней мере некоторых белков происходит в лизосомах. В качестве примера можно привести цитохром Р450, содержащийся в эндоплазматическом ретикулуме.

Два интересных примера обновления мембранных белков

Стабильность белков в клетке определяется множеством различных факторов. Особенно интересным примером деградации мембранных белков является гидроксиметилглутарил-СоА-редуктаза. Этот фермент находится в гладком эндоплазматическом ретикулуме и регулирует эндогенный синтез холестеро-ла. Деградация его происходит довольно быстро и ускоряется при взаимодействии с холестеролом. Для ускорения процесса необходимо наличие мембраносвязанного домена фермента. При определенных условиях в культуре ооцитов китайского хомячка наблюдается сверхпродукция этого фермента. В результате образуются мембранные трубочки, занимающие 15% клеточного объема и содержащие другие мембранные белки, а также липиды. Добавление холестерола приводит к быстрой деградации избытка мембран, что говорит о координации синтеза и деградации мембранных компонентов.

Другим интересным примером селективного метаболизма мембранных белков является гербицидсвязывающий белок с мол. массой 32 кДа из тилакоидов хлоропластов. Этот белок синтезируется как предшественник, созревая внутри отдельных ламелл тилнкоида, не собранных в граны, и является частью фотосистемы II в ламеллах, входящих в граны. На свету скорость деградации этого полипептида в мембране намного выше, чем других белков. Причина этого явления неизвестна; возможно, оно связано с тем, что в фотосистеме II на свету происходят какие-то повреждения.

9. Биосинтез и распределение мембранных липидов

В мембранах эукариотических клеток обнаружено огромное количество разных липидов, причем они не распределены равномерно по разным клеточным мембранам. Эта неравномерность относится к распределению как полярных головок, так и ацильных хвостов. Например, степень ненасыщенное™ фосфолипидов в общем случае уменьшается при переходе от эндоплазматического ретикулума к комплексу Гольджи и затем к плазматической мембране. Для животной клетки среднее молярное отношение холестерол/фосфолипиды равно 0,3— 0,4, при этом для плазматической мембраны оно гораздо выше, чем для других мембран, таких, как шероховатый эндоп-лазматический ретикулум. Кроме того, для многих мембран характерно неравномерное распределение липидов и по разным половинам бислоя.

Вопрос о механизме создания и поддержания такой асимметрии очень интересен и сложен. Напомним, что многие мембраны эукариотических клеток участвуют в эндоцитозе и экзоцитозе, при которых от одних мембран везикулы отпочковываются, а с другими сливаются. Этот процесс селективен для белков, которые транспортируются с помощью везикул, но почему-то не приводит к идентичности липидного состава вовлекаемых в него мембран. Причина этого явления неизвестна, выяснены лишь некоторые его аспекты. Рассмотрим, где синтезируются мембранные липиды, а затем обсудим, как они могут транспортироваться к месту назначения.

10. ГДЕ СИНТЕЗИРУЮТСЯ МЕМБРАННЫЕ ЛИПИДЫ?

Прокариоты

У Е. coli весь синтез фосфолипидов протекает в плазматической мембране. В общих чертах этот процесс представлен на рис. 10.16. Жирные кислоты синтезируются в виде предшественников, ковалеитно связанных с белком — переносчиком ацила, а затем включаются в мембрану путем ацилирования с образованием CDP-диацилглицерола. Два ацилирующих фермента проявляют предпочтение к ненасыщенным жирнокислотным группам, находящимся в положении sn-2. На уровне CDP-диацилглицерола происходит разветвление процесса, после чего образуется фосфатидилсерин или фосфатидилглицерол.

Механизм регуляции равновесного соотношения между фосфолипи-дами почти не изучен. В штаммах, в которых фермент, необходимый для биосинтеза кардиолипина, синтезируется в количествах, в 10 раз превышающих норму, наблюдается лишь незначительное увеличение содержания этого фосфолипида в мембране. Аналогичные результаты были получены для фосфатидилсеринсинтазы и фосфатидилглицеролфосфатсинтазы. Сверхпродукция этих ферментов оказывает лишь небольшое влияние на фосфолипидный состав мембраны. С другой стороны, полное отсутствие фосфатидилглицеролфосфат-синтазы губительно для клетки, вероятно, потому, что кислые фос-фолипиды необходимы для обеспечения предшественниками других биосинтетических реакций или участвуют в регуляции. Получены мутанты, содержащие очень мало фосфатидилглицеролфос-фатсинтазы, у которых единственным основным фосфолипидом является фосфатидилэтаноламин. Очищены некоторые ферменты биосинтетического пути, в том числе CDP-диглицеридсинтаза и фосфатидилсеринсинтаза. Первый фермент, как и ожидалось, связан с мембранами, но фосфатидилсеринсинтаза связана с рибосомами в бесклеточных экстрактах Е. coli.

Эукариоты

На рис. 10.17 представлена более сложная суммарная схема биосинтеза фосфолипидов в эукариотических клетках. Синтез жирных кислот происходит как в эндоплазматическом ретикулуме, так и в митохондриях. В качестве субстрата используется ацил-СоА, поскольку животные клетки не содержат эквивалента белку — переносчику ацила. Большинство ферментов, участвующих в биосинтезе фосфолипидов, локализовано на цитоплазматической стороне мембраны эндоплазматического ретикулума, но есть и исключения. В эукариотических клетках, как и в Е. coli, синтез фосфатидилглицерола и кардиолипина может осуществляться через промежуточное образование CDP-диацилглицерола. Однако ферменты, необходимые для этого, содержатся во внутренней мембране митохондрий, и эти фосфолипиды обнаруживаются только в митохондриях. Низшие эукариоты тоже могут синтезировать фосфати-дилсерин с помощью механизма, используемого Е. coli, но соответствующий фермент обнаружен как в эндоплазматическом ретикулуме, так и в митохондриях. В дрожжах на долю фосфатидил-серина приходится только около 5% всех фосфолипидов, но он является предшественником фосфатидилэтаноламина и фосфатиднл-холина.