Биогенез мембран (стр. 8 из 11)

При сравнении сигнальных последовательностей, ответственных за транспорт белков в митохондрии, выявляется не какая-то специфическая последовательность, а скорее общая тенденция этих сигналов к образованию положительно заряженных амфифильных спиралей. Как правило, эти последовательности вообще не несут отрицательных зарядов или слабо заряжены, причем лизиновые н аргининовые остатки расположены таким образом, что при формировании а-спирали они оказываются в основном на одной из ее сторон, образуя область с четко выраженными гидрофобными свойствами. Такие амфифильные последовательности очень часто встречаются в растворимых белках. Показано, что внутренние последовательности из цитозольного фермента дигидрофолат-редуктазы, а также последовательности, образованные случайным образом из генома Е. coli, будучи присоединенными к белку-пассажиру, инициируют транспорт этого белка в митохондрию. Роль таких сигналов могут играть многие искусственные последовательности. Интересно отметить сходство между сигналом, ответственным за транспорт белка в митохондрию, и предполагаемой амфифильной спиралью, которая, по-видимому, образует «датчик напряжения» в ионных каналах. Очевидно, что для узнавания рецепторов, участвующих в импорте в митохондрию, существенны скорее некоторые особенности вторичной структуры, чем наличие характерных аминокислотных остатков. Как мы уже говорили, хорошую модель рецептора, способного связывать множество разнообразных пептидов, представляет антиген гистосовместимости HLA-A2.

Показано, что синтезированные химическим способом пептиды, соответствующие митохондриальным сигнальным последовательностям, связываются с липидными би- и монослоями и образуют спираль в присутствии некоторых фосфолипидов и детергентов. Кроме того, один из синтезированных пептидов блокирует импорт предшественников митохондриальных белков, возможно связываясь со специфическими рецепторами. Полагают, что сигнальная последовательность сначала вызывает концентрирование предшественника в мембранах, а затем связывание со специфическим рецептором в наружной мембране. Как видно из рис. 8, необходимым условием связывания является наличие трансмембранного потенциала на внутренней мембране. Исходя из предложенной модели амфнфильный сигнальный пептид сначала связывается с поверхностью мембраны, а затем продвигается внутрь ее под действием разности потенциалов. Такая промежуточная структура положительно заряженной спирали, погруженной в мембрану, конечно, нестабильна. Однако, если энергетический барьер перехода в это состояние меньше, чем примерно 18 ккал/моль, то пептид все же может пересекать мембрану с приемлемой скоростью. Впрочем, это маловероятно, особенно если учесть высокую плотность гидроксилированных аминокислот, обычно присутствующих в препоследовательностях помимо других положительно заряженных аминокислот. Согласно альтернативной модели, трансмембранный потенциал влияет на рецепторные белки или предполагаемый канал внутри мембраны, через который осуществляется перенос. Отметим, что для переноса в строму хлоропласта не требуется наличия трансмембранного потенциала, хотя сигналы, ответственные за транспорт белков в эти органеллы, сходны.

6. СИГНАЛЬНЫЕ ПЕПТИДАЗЫ

Для удаления временных N-концевых сигнальных пептидов необходимы специфические белки. Наиболее полно охарактеризованы сигнальные протеазы из Е. coli. Большинство экспортируемых белков Е. coli содержат сигнальный пептид, который отщепляется на периплазматической поверхности внутренней мембраны с помощью лидер-пептидазы; ее структура представлена на рис. 10.12. Для переноса белков через внутреннюю мембрану эта пептидаза не нужна, но она необходима для высвобождения экспортируемого белка из цитоплазматической мембраны. In vitro очищенный фермент мог функционировать, будучи включенным в липосомы. Специфичность расщепления весьма высока, но не определяется исключительно аминокислотной последовательностью вблизи сайта расщепления. Сигнальная пептидаза, функционирующая в эидоплазматическом ретикулуме, имеет ту же специфичность, что и соответствующий фермент Е. coli, что неудивительно, если учесть сходство сигнальных последовательностей. Была очищена сигнальная пептидаза из микросом эукариот. Показано, что она ассоциирована с другими полипептидами, возможно имеющими отношение к механизму переноса.

У Е. coli имеется вторая сигнальная пептидаза, участвующая в процессинге пролипопротеинов. Эти полипептидные компоненты оболочки Е. coli замечательны тем, что при созревании их N-конец модифицируется с помощью глицерида. Пролипопротеи-новая сигнальная пептидаза также находится в цитоплазматической мембране. После отщепления сигнальный пептид остается в цитоплазматической мембране и разрушается с помощью мембра-носвязанного фермента протеазы IV.

В митохондриях и хлоропластах должно присутствовать несколько сигнальных пептидаз, поскольку процессинг происходит более чем в одном компартменте. Растворимую пептидазу из митохондриального матрикса удалось частично очистить, но охарактеризована она не полностью.

7. РАСТВОРИМЫЕ И МЕМБРАНОСВЯЗАННЫЕ БЕЛКИ, НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ ПЕРЕНОСА

Идентифицировано несколько цитозольных и мембраносвязан-ных белковых компонентов, необходимых для переноса. Наиболее детально охарактеризованы белковые факторы, участвующие во встраивании белков в эндоплазматический ретикулум млекопитающих.

1. Сигнал-распознающая частица. Это растворимый рн-бонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из шести разных белков и молекулы 7S-PHK. СРЧ необходима для инициации переноса. Она связывается с сигнальной последовательностью образующегося полипептида во время его синтеза на рибосоме. Для препролактина, например, константа диссоциации составляет 1 нМ. С помощью метода фотохимического сшивания был идентифицирован один из полнпептидов, непосредственно взаимодействующий с сигнальной последовательностью предшественника. По некоторым данным, полученным для бесклеточных систем, связывание СРЧ ингибирует трансляцию или вызывает ее задержку. Впрочем, не исключено, что этот феномен является артефактом; во всяком случае, как было показано на модельных опытах, его не обязательно привлекать для объяснения кинетики переноса белков in vivo. Одна из вероятных функций СРЧ состоит в предотвращении неправильного свертывания образующегося полипептида, которое может блокировать перенос. Задержка трансляции должна уменьшать вероятность такого ошибочного свертывания и, следовательно, увеличивать эффективность переноса белков.

Некоторые небольшие белки транспортируются в эн-доплазматический ретикулум независимо от СРЧ. В их число входят препропептид GLa лягушки, препромелиттин и пробелок оболочки фага М13. Во всех этих примерах конформация предшественника такова, что белки должны оставаться способными к переносу даже в отсутствие СРЧ и рибосом.

2. Рецептор СРЧ, или стыковочный белок. Комплекс СРЧ/ рибосома/образующаяся полипептидная цепь транспортируется в шероховатый эндоплазматический ретикулум, преодолевая энергию сильного взаимодействия между СРЧ и мембраносвязанным рецептором СРЧ, называемым также стыковочным белком. Рецептор СРЧ содержит субъединицу с мол. массой 73 кДа, присоединенную N-концом к мембране. Вероятно, рибосома также связывается со специфическими рецепторами, присутствующими в мембране.

3. Рецептор сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность на образующейся полипептидной цепи перемещается от СРЧ ко второму рецептору, находящемуся в мембране и называемому рецептором сигнальной последовательности. Об этом свидетельствуют результаты опытов по фотохимическому сшиванию, в которых используется метка, связанная с сигнальной последовательностью препролактина. Предполагаемый мембраносвязанный рецептор представляет собой гликопротеин с мол. массой 35 кДа. Возможно, он образует часть канала, через который осуществляется перенос. С помощью такого же подхода с использованием поперечной сшивки и синтетического сигнального пептида был обнаружен еще один кандидат на роль рецептора сигнальной последовательности. Связь между этими двумя белками неизвестна и функции их до конца не установлены. Как только образовавшаяся полипептидная цепь связывается с мем-браносвязанным рецептором, СРЧ и ее рецептор могут освободиться от рибосомы и принять участие в новом цикле. О предполагаемом канале, участвующем в переносе, ничего не известно; очистка его является довольно сложной задачей.

Было показано, что для переноса белков через эндоплазматический ретикулум дрожжей необходимы растворимые факторы, однако их сходство с СРЧ не установлено. Перенос различных секретируемых белков в дрожжах может происходить после завершения трансляции, поэтому не исключается, что в этих случаях образующиеся полипептидные цепи взаимодействуют с мембрано-связанным рецептором сигнальной последовательности. По-видимому, растворимые белковые факторы необходимы и для экспорта белков в Е. coli, а также для импорта белков в митохондрию, но охарактеризовать их не удалось. Было показано, что продукт гена secY, необходимый для экспорта белков в Е. coli, является мембраносвязанным, но его функция остается неизвестной.

Определенные успехи были достигнуты при идентификации рецептора на наружной митохондриальной мембране, необходимого для импорта белков. Опыты по связыванию с порином показали, что на мембране имеется некий рецептор с высоким сродством, который участвует в импорте ADP/ATP-переносчика, белка внутренней мембраны. Идентифицированы два разных полипептида — компонента рецептора сигнальной последовательности наружной мембраны. При этом использовались два метода: блокирование импорта белков ан-тителами и химическое сшивание с синтетическим сигнальным пептидом. Интересно, что импорт в митохондрии, по-видимому, не связан с наружной мембраной, которая удаляется при образовании митопластов. Это наблюдение позволяет предполо-