Биогенез мембран (стр. 5 из 11)

частью иммунного ответа. Область связывания пептида представляет собой большой желобок, открытый с одного конца и способный вмещать пептид из 20 аминокислотных остатков, если тот имеет форму а-спирали. О пептидах, которые могут связываться с HLA-A2, известно немного; показано, в частности, что близкородственный антиген гист©совместимости класса II проявляет высокое сродство к самым разным аминокислотным последовательностям. По-видимому, наиболее важными ббщими характеристиками пептидов, которые могут связываться с высоким сродством, являются вторичная структура и амфифильность. Стабилизации комплекса могут способствовать многочисленные взаимодействия в области связывания.

Известно, что относительно небольшие различия между сигнальными последовательностями порождают огромные различия в поведении белка. Например, если сигнальная последовательность не распознается сигнальной пептидазой, то белок чаще остается связанным с мембраной, чем секретируется, хотя есть и исключения из этого правила. Обычно сигнальные последовательности, которые служат также N-концевыми якорями,

имеют более протяженный гидрофобный h-участок длиной около 20 аминокислотных остатков; этот участок необходим для остановки переноса и/или образования стабильного якоря в мембранном бислое. Примером такой сигнальной/якорной последовательности служит трансферриновый рецептор. Заметим, что в этом случае сигнальная последовательность расположена не иа N-конце, а на расстоянии более чем 50 аминокислотных остатков от него.

Известны также случаи, когда сигнальная последовательность закрепляет зрелый белок в противоположной ориентации, т. е. N-конец оказывается обращенным наружу. В качестве примера можно привести цитохром Р450 микросом крысы, инвариантную церь антигенов гистосовместимости класса II мыши, несколько вирусных белков и Н-субъединицу реакционного центра R. viridis. Каким-то образом эти сигналь-ные/якориые последовательности «проталкивают» свой N-коиец через мембрану и останавливают трансляцию, так что основная часть белка остается в цитоплазме. Отмечалось, что в некоторых из этих случаев сигнальные последовательности «старт/стоп» несут, по крайней мере, одни отрицательный заряд в n-области. Однако для встраивания указанных мембранных белков, как и белков обычного типа, используется одинаковый аппарат переноса — СРЧ. Возможно, наличие отрицательного заряда облегчает самопроизвольный или опосредованный белком перенос N-концевых остатков через мембрану.

Как мы уже отмечали, сигнальные последовательности не обязательно находятся на N-конце белковой молекулы и могут направлять перенос обоих фланкирующих домеиов, по крайней мере в случае искусственных гибридных белков. Уникальным примером такого рода является овальбумин, секреция которого детерминируется неотщепляемой внутренней сигнальной последовательностью. У многих мембранных белков эндоплазматического ретикулума неотщепляемые сигнальные последовательности тоже расположены в средней части полипептидиой цепи и играют роль трансмембраниых якорей. В качестве примера можно привести асиалогликопротеиновый рецептор. Внутренняя сигнальная последовательность этого белка использует тот же аппарат переноса, что и N-концевая последовательность; и действительно, в искусственных гибридах эта внутренняя сигнальная последовательность функционирует как обычная N-концевая последовательность. Примерами белков с внутренней неотщепляемой сигнальной последовательностью, которые имеют многочисленные трансмембраниые сегменты и N-конец которых находится на внутренней стороне мембраны, служат переносчик глюкозы и анионный переносчик белок полосы 3. Напротив, у опсина, тоже содержащего внутренний неотщепляемый сигнальный пептид, N-конец находится с наружной стороны мембраны. Этот внутренний сигнал протягивает гидрофильный аминокислотный домеи через мембрану, и, таким образом, его ориентация противоположна той, которая наблюдается в более общем случае при переносе полипептида, начиная с С-конца. Причина такого поведения опсина неизвестна; возможно, важную роль играет природа N-концевого пептида.

Итак, от небольших изменений в сигнальных последовательностях зависит, будет ли «белок-пассажир» секретироваться в полость эндоплазматического ретикулума или ои останется прикрепленным к мембране, н какой будет ориентация N-конца мембранного белка. Было показано, что существуют все возможные топологические варианты. Важным моментом является то, что во всех случаях сборка осуществляется при помощи одного и того же аппарата.

Стоп-сигналы переноса

Для неотщепляемых сигнальных последовательностей, которые играют роль N-концевых якорей в образовавшемся мембранном белке, характерно наличие относительно длинных гидрофобных участков. Отсюда следует, что перенос может останавливаться просто при наличии протяженного гидрофобного участка, который способен образовать трансмембранную а-спираль. В пользу такого предположения свидетельствуют некоторые экспериментальные данные. Например, с помощью рекомбинантной ДНК в среднюю часть белка Е. coli, в норме секретирующегося через плазматическую мембрану, встраивали гидрофобные сегменты. Если их длина была не менее 16 аминокислотных остатков, то транспорт белка блокировался, и он оставался присоединенным к плазматической мембране. Можно возразить, что в данном случае речь идет о бактериальной системе, но, как мы увидим ниже, механизмы переноса в про- и эукари-отических системах, по-видимому, сходны. Далее были сконструированы варианты G-белка вируса везикулярного стоматита с измененными мембранными доменами. Длина гидрофобного сегмента могла составлять не 20, а 8 остатков, при этом полипептид оставался трансмембранным, хотя транспорт в плазматическую мембрану блокировался. Таким образом, природа стоп-сигнала переноса точно не известна. Необходимо выяснить два вопроса: 1) участвуют ли в остановке процесса специфические белки аппарата переноса; 2) определяется ли остановка переноса гидрофобиостью стоп-сигнала или какими-то более тонкими факторами? Было показано, что участки стоп-сигнальиой последовательности, ответственные за блокирование переноса через эндоплазматический ретикулум, могут никак не влиять на транспорт через мембрану хлоропласта. Это означает, что упомянутые два процесса могут существенно различаться.

Определение старт- и стоп-сигналов подразумевает линейную схему переноса, начинающегося с N-конца; об этом свидетельствует поведение простых систем. Однако оказалось, что последовательности, которые блокируют перенос в одном случае, могут инициировать его в другом. Следовательно, важна не только природа самих стоп- или старт-последовательностей, но и их окружение в полипептиде.

Вторичные сигналы экэоцитозной системы

Функция сигнального пептида состоит в направлении белков в эндоплазматический ретикулум и в инициации переноса. Из рис. 10.1 видно, что как мембранные белки, так и растворимые белки, которые попадают в полость эндоплазматического ретикулума, имеют несколько мест назначения. Информация, определяющая их локализацию, каким-то образом кодируется в зрелом полипептиде. В отсутствие вторичного сигнала водорастворимые белки секрети-руются с помощью «конститутивной» секретирующей системы. Достигнуты определенные успехи в идентификации сигналов, ответственных за направление растворимых белков в лизо-сомы или секреторные гранулы либо за удержание их в эндоплаз-матическом ретикулуме или пузырьках Гольджи. Возможно, участки этих полипептидов взаимодействуют с мембранными рецепторами, вызывая замедление их экспорта.

О сигналах, ответственных за локализацию интегральных мембранных белков в экэоцитозной системе, известно немного. По-видимому, за фиксацию белка Е19 аденовируса в мембране эндоплазматического ретикулума отвечает короткая последовательность на С-конце молекулы. Этот белок имеет единственный трансмембранный сегмент и цитоплазматический «хвост» из 15 остатков на С-конце. Уменьшение длины «хвоста» только на восемь аминокислотных остатков приводит к транспорту белка из эндоплазматического ретикулума. Возможно, сигнальный участок взаимодействует прямым или косвенным образом с некой цитоплазматической структурой, что обеспечивает заякоривание белка Е19 в эндоплаз-матическом ретикулуме. Исследования гликопротеина Е1 коронави-руса показали, что сигнальная последовательность, ответственная за его нахождение в аппарате Гольджи, локализована в одной из трех предполагаемых трансмембранных спиралей.

Сходная проблема сортировки возникает при выявлении вторичных сигналов, ответственных за направление мембранных белков в нужный домен плазматической мембраны в поляризованных эпителиальных клетках. В этой работе использовались в основном вирусы с оболочкой, которые отпочковываются либо от апикальной, либо от базолатеральной поверхности эпителиальных клеток в культуре. Так, G-белок вируса везикулярного стоматита локализован исключительно в базолатеральной области мембраны, от которой вирус и отпочковывается, а гликопротеин гемагглютинина транспортируется к апикальной области. Химерный гибрид,

Таблица 1. Сигналы для сортировки белков в эукариотических клетках

нанты аминокислотной последовательности
неизвестны
2.	Эндоплазматиче-	Короткая последовательность на С-
ский ретикулум	коице отвечает за удерживание некоторых
мембранных компонентов и компонентов
просвета эндоплазматического ретикулума
3.	Аппарат Гольджи	Сигнальная последовательность находится	[899)
в одном из трансмембраниых сегментов
гликопротеииа Е1 короиавируса
4.	Апикальная или ба-	В некоторых случаях сигнал, определяю-	[937, 958,
золатеральная об-	щий конечную локализацию, содержит	1186]
ласть плазматиче-	внецитоплазматический домеи, но какую-
ской мембраны	то роль может также играть цито-
плазматический домен
5.	Секреторные	Сигнал для трипсиногеиа не требует нали-	(1249]
гранулы	чия сигнального пептида (первичный сиг-
нал) или первых 12 аминокислотных
остатков на N-коице нативиого белка
6.	Конститутивная	Укороченный путь в отсутствие вторич-
секреция	ных сигналов

состоящий из внецитоплазматического домена НА, а также мембранного сегмента и цитоплазматического «хвоста» G-белка, локализуется исключительно в апикальной области мембраны. Эти и другие эксперименты свидетельствуют о том, что решающее значение для локализации имеет внецитоплазматический домен. Однако существуют данные о том, что цитоплазматический домен тоже может содержать важные сортировочные детерминанты. По-видимому, сортировка белков плазматической мембраны в поляризованных эпителиальных клетках происходит в аппарате Гольджи. Однако в гепатоцитах крысы наблюдается иная картина: все белки плазматической мембраны, очевидно, направляются сначала в базолатериальную область.