Биогенез мембран (стр. 2 из 11)

Белки при транспортировке по экзоцитозному пути подвергаются посттрансляционным модификациям, в частности гликозилиро-ванию. Хорошо изучена компартментация процессинга N-связанного олигосахарида, что очень помогло определению различных компонентов комплекса Гольджи. Олигосахаридный предшественник с высоким содержанием маннозы присоединяется по местам гликозилирования в полипептиде, когда белок находится внутри эндоплазматического ретикулума, а затем с помощью нескольких расположенных в различных компарт-ментах ферментов осуществляется процесс созревания. Это позволяет следить за превращением белков, определяя состояние их гликозирования. На рис. 10.5 представлен

процессинг олитосахаридного предшественника с высоким содержанием маннозы.

В исследованиях экзоцитозного пути был достигнут значительный прогресс благодаря использованию вирусов с оболочкой, в частности вируса везикулярного стоматита. Гликопротеин шиловидной структуры вируса везикулярного стоматита, называемый G-бел-ком, — это трансмембраниый белок, который синтезируется на рибосомах, связанных с эндоплазматическим ретикулумом, после инфекции. С помощью экзоцитозного пути G-белок попадает на плазматическую мембрану, где он участвует в образовании отпочковывающегося вируса. Инфицируя клетки этим вирусом, можно проследить за процессингом кодируемого вирусным геномом G-белка, что позволит исследовать экзоцитозный путь. Этот подход используется для идентификации везикул, участвующих во внутриклеточном транспорте, для изу-

чения влияния гликозирования на доставку белков к клеточной поверхности, для исследования энергетики экзоцитозного транспорта и, что наиболее важно, для создания бесклеточной системы везикулярного внутриклеточного транспорта.

Эти исследования выявили несколько замечательных особенностей системы экзоцитозного транспорта.

1. Транспорт между различными компартментами органеллы осуществляется с помощью везикул, которые отпочковываются от «донорной» мембраны и потом сливаются с «акцепторной». Показано, что везикулы, участвующие в транспорте между компартментами комплекса Гольджи, являются «окаймленными», но соответствующий белок отличается от клатрина, окаймляющего эндоци-тозные везикулы. Имеются веские данные в пользу того, что клатрин не является существенным компонентом экзоцитозного пути, хотя он, по-видимому, необходим для нормального роста некоторых штаммов дрожжей. Степень общности ком-

поиентов эидоцитозного и экзоцитозного путей неясна, хотя некоторые везикулы, вероятно, функционируют в обоих случаях.

2. Для внутриклеточного транспорта необходим АТР, а также белковые компоненты цитозоля. Показано, что для транспорта между цистернами Гольджи, осуществляющегося при участии везикул, необходимо жирнокислотное производное ацил-СоА. Какую именно функцию выполняют указанные соединения в отпочковывании и слиянии везикул, неизвестно.

3. Роль олигосахарида как сигнала сортировки новосинтезиро-ванных гликопротеинов, по-видимому, непостоянна. Известны случаи, когда процессинг N-концевого углевода не является необходимым для экспрессии белка плазматической мембраны на клеточной поверхности. В других системах гликозилирование существенно для доставки белка к клеточной поверхности, например, оно необходимо для включения опсина в мембрану наружного сегмента палочки сетчатки. Во многих клетках млекопитающих сигналом сортировки для белков, направляемых в лизосомы, является маннозо-6-фосфат, однако для дрожжей это не характерно. В тех клетках млекопитающих, где маннозо-фосфат функционирует как сигнал сортировки, обнаружены два мембранных рецептора с высоким сродством к гликопротеинам, содержащим маннозо-6-фосфат, и клонированы их гены. Они играют ключевую роль в процессе переноса конкретных полипептидов в лизосомы, а один из этих рецепторов существен как для эндоцитоза, так и для экзоцитоза.

Исследование бесклеточной системы, изображенной на рис. 10.6, показало, что для изучения таких сложных систем полезно использовать специфические мутанты. Выделено множество мутантных штаммов дрожжей, дефектных по разным стадиям экзоцитозного пути, и некоторые из них использовались при создании бесклеточной системы транспорта между органеллами. Оказалось, что системы дрожжей и млекопитающих весьма сходны, и для исследования последних можно с успехом использовать му-тантные штаммы дрожжей. Наконец, обнаружено, что многие вирусы с оболочкой способны отпочковываться не только от плазматических, но и от других мембран и, таким образом, могут быть полезны для изучения других аспектов внутриклеточной сортировки белков и мембранного транспорта.

Изучение внутриклеточного транспорта, осуществляемого с помощью везикул in vitro

На рис. 6 схематически представлен метод изучения транспорта вирусного G-белка между соседними компартментами комплекса Гольджи in vitro. Важной особенностью метода является то, что он позволяет определить биохимическим путем компоненты, необходимые для этого процесса. Из двух типов клеток, обозначаемых как «донор» и «акцептор», выделяют мембранные фракции, содержащие комплекс Гольджи. При этом донорную фракцию получают из мутантных клеток, у которых отсутствует фермент UDP-N-ацетилглюкозамингликозилтрансфераза I и которые были инфицированы вирусом везикулярного стоматита. Процессннг олигосаха-рида, связанного с G-белком, в этих клетках блокирован. Акцепторную фракцию получают из неинфицированных клеток дикого типа. Для присоединения Ы-ацетилглюкозамина к новосинтезирован-ному G-белку должен произойти перенос G-белка от донорной фракции к акцепторной, где необходимый фермент имеется. Количество включенного Ы-ацетилглюкозамина определяют после иммунопреципитации. Данная методика позволяет исследовать транспорт из t/uc-компартмента аппарата Гольджи в медиальный компартмент. Аналогичные работы, в которых наблюдали за присоединением сиаловой кислоты, выявили наличие транспорта in vitro между транс-элементами аппарата Гольджи.

3. Характерные особенности биосинтеза мембранных белков

Проблема сборки белков очень важна. Как мы увидим, этот процесс обычно не протекает самопроизвольно, лишь в результате взаимодействия между образующимися полипептидами и липид-ным бислоем. Напротив, он является энергозависимым и опосредуется белковыми структурами, которые пока не изучены в достаточной степени. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что перенос белков через мембрану и сборка интегральных мембранных белков — это тесно связанные стороны одного и того же процесса. Логично ожидать, что проблемы транспортировки белков через мембраны и их укладки должны решаться одинаковым образом. Прежде чем обсуждать общие особенности сборки молекул в различных системах, полезно остановиться на методах экспериментального исследования этого процесса.

Наиболее детально изучены бесклеточные системы, в которых гораздо легче количественно исследовать процессы переноса и про-теолитического процессинга белков. Во всех этих системах используются мембранные везикулы или препараты органелл, у которых поверхность, обращенная в цитоплазму, «смотрит» наружу, поскольку перенос белков осуществляется из цитоплазмы. Этому условию удовлетворяют микросомы, полученные из эндоплазматического ретикулума секретирующих клеток, митохондрий и хлоро-пластов. Вывернутые везикулы можно получить из клеток Е. coli; они представляют собой удобный объект для изучения переноса белков в бесклеточной системе.

Полипептид-предшественник, находящийся во внешней среде, при соответствующих условиях будет переноситься внутрь пузырька или по крайней мере через мембрану пузырька или органеллы. За этим процессом обычно следят, добавляя протеазы во внешнюю среду. Степень защиты от протеолиза является мерой количества полипептида, транспортированного внутрь везикулы или органеллы. Как показано схематически на рис. 10.7, за ходом протеолити-ческого процессинга, осуществляемого сигнальной пептидазой, следят с помощью электрофореза в полиакриламидиом геле в присутствии ДСН. Белки, встроившиеся в мембрану, можно идентифицировать с помощью щелочной экстракции; при этом предполагается, что белки, которые связаны с поверхностью мембран, при такой обработке удаляются. Однако так бывает не всегда, поэтому результаты, полученные с помощью щелочной экстракции, необходимо интерпретировать с осторожностью.

В таких бесклеточных системах можно изучать биохимические условия переноса белков и идентифицировать необходимые раство-