Хромосома прокариот. Структурные гены подразделяются на три основных типа: независимые гены (транскрибируются без каких-либо механизмов регуляции транскрипционной активности), транскрипционные единицы (транскриптоны – группа следующих друг за другом генов, транскрибируемых совместно, обычно это гены белков или н.к., связанных между собой в функциональном отношении), и опрероны (группа следующих подряд структурных генов, находящихся под контролем участка ДНК - оператора). Кроме того в прокариотической клетке могут находиться более мелкие реплицирующиеся единицы – плазмиды (кольцевые молекулы ДНК, в них есть участки способные к перемещению – транспозоны, они часто содержат гены резистентности к антибиотикам, перемещаясь из одной клетки в другую в процессе коньюгации, гены резистентности быстро распространяются в популяции бактерий).
Клетки эукариот используют в качестве генетического материала лишь двуцепочечную ДНК. Структурные гены в них подразделяются на независимые гены (их транскрипция не связана с транскрипцией других генов, их активность регулируется, например гормонами), повторяющиеся гены (например, ген рибосомной 5S-РНК повторятся много сотен раз, причем повторы следуют вплотную друг за другом) и кластерные гены (это локализованные в определенных участках – локусах – хромосомы группы различных генов с родственными функциями, иногда также в виде повторов, например, кластер гистоновых генов в геноме человека повторяются 10-20 раз). В кодирующие последовательности этих генов могут вклиниваться некодирующие – интроны (разбивают кодирующую – экспрессируемую часть гена – следовательно для полученной с этой матрицы мРНК нужен сплайсинг). Кроме того, между генами могут находиться участки ДНК с большим числом повторов (сателлитной ДНК – в теломерных и центромерных участках хромосомы – функция этой ДНК пока неясна, вероятно структурная) и спейсерной ДНК (располагается между генами), транскрибируемой и нетранскрибируемой.
Неядерные геномы. ДНК митохондрий и хлоропластов.
Отличительная особенность клеток эукариот состоит в том, что часть генетической информации у них заключена в молекулах, находящихся вне хромосом, локализованных в ядре. Существует два таких типа цитоплазматических ДНК: одни – в митохондриях эукариот, другие – в хлоропластах зеленых растений и водорослей. Как и все цитоплазматические элементы, они наследуются по материнской линии, а не по законам Менделя.
ДНК митохондрий. Это замкнутые кольцевые сверхспиральные дуплексные ДНК (прозрачка). Размер у животных около 20 т.п.н., у дрожжей – 80 т.п.н., у растений – от нескольких сотен до нескольких тысяч т.п.н. Митохондриальная ДНК эволюционирует быстрее, чем ядерная, и мутации в ней происходят почти в десять раз чаще. Рассмотрим на примере митохондриальной ДНК дрожжей. Есть гены, кодирующие белки, гены кодирующие РНК, вставочные последовательности, есть сайты начала репликации, кодирующие субединицы АТФ-азного комплекса.
ДНК хлоропластов сходна с ДНК митохондрий. Эта ДНК – кольцевой дуплекс (прозрачка), содержащий какое-то количество (но далеко не все) генов, существенных для функционирования (например, кодирование фрагмента ключевого фермента фотосинтеза – рибулозо-1,5-бифосфат карбоксилаза) и поддержания структуры хлоропластов, и имеет достаточно большую длину – 120-180 т.п.н. в отличие от ДНК митохондрий в пределах вида довольно консервативна.
Есть примеры межгеномного обмена: перенос сегментов хлоропластной ДНК в ядерную ДНК, митохондриальной ДНК в ядерную ДНК (дрожжи, саранча, крыса), хлоропластной ДНК в митохондриальную ДНК. Механизм таких переносов пока не установлен.
Лекция 2. Структура хроматина. Полиморфизм ДНК
В живых организмах молекулы ДНК представляют собой либо очень длинные, либо замкнутые в кольцо двуспиральные молекулы, поэтому любой процесс, связанный с передачей наследственной информации, должен наталкиваться на серьезные топологические проблемы: возникновение положительной (+) или отрицательной (-) сверхспирализации ДНК, образование катенанов или узлов.
Сверхспирализованная ДНК обладает значительным запасом энергии по сравнению с ее релаксированной формой. Следовательно, локальное расплетание двойной спирали ДНК с отрицательными сверхвитками будет приводить к сбросу напряжения сверхспирализации и поэтому энергетически выгодно. Это отчетливо проявляется в том, что отрицательная сверхспирализация заметно стимулирует переход ДНК из правой В-формы в левую Z-форму. Отрицательная сверхспирализация ДНК облегчает связывание с ней белков, раскручивающих ее двойную спираль.
Решение названных топологических проблем обеспечивают ДНК-топоизомеразы — ферменты, изменяющие топологию ДНК (рис. 49). Топоизомеразы релаксируют сверхспирализованные молекулы ДНК, снимая их внутреннее напряжение путем внесения одно и двуцепочечных разрывов с последующим их восстановлением лигированием). По механизму действия различают ДНК-топоизомеразы двух типов — I и II.
ДНК-топоизомеразы I — мономерные белки, релаксируют ДНК без затраты энергии путем внесения одноцепочечных разрывов. ДНК-топоизомеразы II функционируют в виде димеров (у эукариот) и тетрамеров (у прокариот), осуществляя АТР-зависимое расщепление обеих цепей ДНК с последующим переносом цепей через разрыв и его лигированием.
Для внесения одноцепочечного разрыва в ДНК все ДНК-топоизомеразы используют остаток тирозина, который осуществляет нуклеофильную атаку фосфатной группы ДНК с образованием фосфотирозина. В результате ферменты оказываются ковалентно связанными с 5'-или З'-концами ДНК в одноцепочечном разрыве.
Топоизомеразы подтипа 1-5' связываются преимущественно с одноцепочечными участками ДНК,
осуществляя ее разрыв с образованием 5'-фосфодиэфирной связи с тирозином активного центра фермента. Через образовавшийся разрыв проходит либо одноцепочечная ДНК (снятие витка), либо двуцепочечная (образование узла или катенана). Ферменты этого типа снимают только отрицательную суперспирализацию. Характерны для прокариот.
Топоизомеразы подтипа 1-3' связываются с двуцепочечной ДНК, разрывают одну цепь с образованием З'-фосфодиэфирной связи с тирозином активного центра фермента. Через разрыв проходит вторая цепь дуплекса, уменьшая плотность суперспирализации ДНК; знак суперспирализации существенной роли не играет. Характерны для эукариот.
Топоизомеразы типа IIсвязываются с двуцепочечной ДНК и осуществляют разрыв обеих цепей с образованием двух 5'-фосфодиэфирных связей с тирозинами активного центра. В образовавшуюся щель проходит вторая двуцепочечная ДНК, и результатом является изменение числа положительных или отрицательных супервитков на 2 (в отличие от ферментов типа I, изменяющих число супервитков на единицу за шаг).
Этот фермент способен катенировать, декатенировать и развязывать узлы интактной ДНК. Для многократного повторения цикла требуется АТР (рис. 50).
Топоизомераза IIЕ. coli(ДНК-гираза) относится к ферментам типа II, но не требует АТР. Она индуцирует образование отрицательных супервитков в релаксированных кольцевых ДНК. Гираза взаимодействует с ДНК таким образом, что последняя наматывается вокруг белка. При этом возникает положительная сверхспирализация в тех местах молекулы ДНК, которые связаны с белком. Затем фермент разрывает обе нити ДНК и переносит двойную нить с внутренней стороны на внешнюю, после чего скрепляет оба разрыва, превращая положительную петлю в отрицательную (рис. 51). Это особенно важно для инициации репликации, а также необходимо для ее элонгации и терминации.
ДНК-топоизомераза II является жизненно важным ферментом любого эукариотического организма. Выяснена роль ДНК-топоизомеразы в формировании высших уровней структуры хроматина, а именно, участии фермента в образовании петель хроматина во время конденсации хромосом.
Гистоны составляют большинство основных белков хроматина и находятся примерно в том же количестве, что и ДНК. По относительной доле основных аминокислот каждого типа, которую выражают отношением лизин/аргинин, сначала охарактеризовали пять типов гистонов. След этой классификации до сих пор остается в названиях гистонов. Практически у всех эукариот обнаруживают одни и те же классы гистонов. Их свойства суммированы в табл. 29.1.
Гистоны четырех классов прямо взаимодействуют с ДНК и образуют в хроматине серию частиц первого уровня организации. Консервативность типов гистонов на протяжении эволюции можно объяснить необходимостью сохранения этой важнейшей реакции. Пятый класс гистонов принимает участие во взаимодействиях между частицами. Постоянство классов гистонов позволяет предполагать, что взаимодействия типа ДНК—гистоны, гистон—гистоны и гистон—негистоновые белки могут быть в основном похожими у разных видов. Отсюда мы можем сделать заключение об общих механизмах образования как первичных частиц, так и последующих структур более сложного порядка, состоящих из серий частиц.
Гистоны первых четырех классов имеют значительное количество как кислых, так и основных аминокислот. Поэтому эти белки несут высокий заряд. Отношение основных аминокислот к кислым находится в диапазоне 1,4-2,5. Эти гистоны подразделяются на две группы.
К аргинин-богатым относятся два вида гистонов: Н3 и Н4. Они принадлежат к наиболее консервативным из всех известных белков. Аминокислотные последовательности этих белков идентичны даже у таких удаленных видов, как корова и горох. В гистонах Н3 и Н4 других видов обнаружены только редкие аминокислотные замены. Консервативность целой последовательности говорит о том, что все ее аминокислоты имеют существенное значение для выполнения функции белка. По логике вещей эта функция должна быть одинаковой у огромного большинства различных видов, что свидетельствует в пользу концепции об общей основе для структуры хроматина.