Активность ФМСФ - ингибируемой карбоксипептидазы определяли как разность в накоплении продуктов реакции в пробах, содержащих и не содержащих ФМСФ и выражали в нмоль дансил-фен-лей, образовавше-гося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.
2.2.5.Метод определения активности АПФ.
Активность АПФ также определялась флюориметрически. В качестве субстрата использовали дансил-фен-ала-арг, приготовленный на воде. В качестве ингибитора использовали высокоспецифичный ингибитор АПФ - каптоприл.
Контрольные пробы содержали 100 мкл 200 мМ трис НСl рН 7,6 и 100 мкл препарата фермента. В опытные пробы вносили 90 мкл указанного буфера, 10 мкл 25 мМ каптоприла, приготовленного на воде и 100 мкл гомогената. Пробы преинкубировали в течение 8 мин при 370С, затем в каждую пробу прибавляли предварительно нагретый до 370С раствор субстрата дансил-фен-ала-арг объемом 50 мкл. Реакционные смеси инкубировали в течение 30 мин при 37 0С, реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1н раствора НСl. Далее пробы обрабатывали по схеме, приведенной для КПН.
Активность фермента определяли как разницу в приросте флюорисценции в пробах содержащих и не содержащих ингибитор АПФ - каптоприл и выражали в нмоль дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.
2.2.6. Методы определения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ in vitro
В опытах in vitro, влияние лей-энкефалин-арг на активность ферментов изучали в гомогенатах гипофиза, надпочечников и больших полушарий. Раствор лей-энкефалин-арг добавляли непосредственно в среду инкубации, концентрация исследуемого предшественника составляла 2,4 мМ. Все последующие операции по определению активности ферментов проводили по схеме, описанной выше.
2.2.7. Метод определения содержания белка
Содержание белка в пробах определяли по методу Лоури [65]. Метод основан на способности белка окрашиваться раствором Фолина. В качестве стандарта для построения калибровочной кривой использовали БСА.
2.2.8.Статистическая обработка результатов исследования.
Результаты подвергали статистической обработке с использованием t-критерия Стьюдента, различия считали достоверными при p<0,05 [98].
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
3.1. РЕГИОНАЛЬНОЕ И ТКАНЕВОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КПН, ФМСФ-ИНГИБИРУЕМОЙ КП И АПФ У САМЦОВ КРЫС.
Известно, что уровень биологически активных пептидов регулируется пептидгидролазами, которые отщепляют остатки аргинина и лизина с С-конца пропептидов. Неоднородное распределение нейропептидов, а также разница в течение процессинга регуляторных пептидов в тканях (нервной и периферической) [14, 212, 271] указывают на необходимость изучения тканевого и регионального распределения активности ферментов их обмена. Особый интерес вызывает изучение распределения активности ФМСФ-ингибируемой КП - фермента, биологическая роль которого в полной мере не определена. Важным представляется, также, сравнение уровня активности этого фермента с активностью КПН и АПФ - ферментов, тканевое и региональное распределение и биологическая роль которых известны.
Результаты исследования распределения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в отделах мозга и некоторых периферических тканях представлены в таблице 1 (приложение).
3.1.1.Распределение активности КПН.
Максимальная активность КПН обнаружена в гипофизе - отделе, синтезирующем группу биологически активных пептидов. В отделах мозга активность КПН примерно в 6-7 раз ниже, чем в гипофизе. По убыванию активности КПН отделы мозга можно расположить следующим образом: средний мозг, гипоталамус, гиппокамп. В этих регионах мозга секреторные пептиды не синтезируются, однако данные отделы характеризуются достаточно высоким их содержанием [221]. Далее по убыванию активности КПН следуют стриатум и большие полушария, уровень активности фермента, в которых примерно одинаков. В семенниках и надпочечниках активность КПН на порядок ниже, чем в отделах мозга.
Таким образом, высокая активность КПН обнаружена в отделах мозга, связанных с образованием, секрецией или высоким содержанием регуляторных пептидов [221]. Полученные данные хорошо согласуются с литературными о распределении активности КПН [39, 40, 193, 194].
Следует указать на то, что в наших исследованиях активность КПН определялась как активность, ингибируемая ГЭМЯК, являющейся высокоспецифичным ингибитором КПН, в то время как другие авторы использовали данные по активности КПН, стимулируемой ионами Со2+ [188, 193, 194], что предполагает несколько завышенные результаты, не всегда соответствующие действительному уровню активности этого фермента в мозге и тканях. В связи с этим значения активности КПН в наших исследованиях несколько ниже значений, имеющихся в литературе.
3.1.2. Распределение активности АПФ.
Максимальная активность АПФ у интактных животных обнаружена в гипофизе. В стриатуме активность АПФ примерно в 3 раза ниже. В других отделах мозга и надпочечниках активность фермента находится на уровне предела чувствительности метода. Высокая активность АПФ обнаружена также в семенниках.
Таким образом, полученные данные хорошо согласуются с распределением регуляторных пептидов в мозге и периферических тканях крыс, что подтверждает участие данного фермента в процессах модификации белков и пептидов в этих регионах.
3.1.3.Распределение активности ФМСФ-ингибируемой КП
Полученные данные свидетельствуют, что активность ФМСФ-ингибируемой КП обнаружена во всех исследуемых регионах мозга и периферических тканях крыс (табл.1). Наибольшая активность фермента показана в надпочечниках, в гипофизе активность составляет 74% от активности ФМСФ-ингибируемой КП в надпочечниках, в других отделах активность примерно одинакова и составляет 23% от активности фермента в гипофизе.
Данные наших исследований о сравнительно высокой активности ФМСФ-ингибируемой КП в надпочечниках и гипофизе, отделах, характеризующихся высоким содержанием нейропептидов, а также их интенсивным метаболизмом [14, 34], указывают на вероятность вовлечения этого фермента в обмен биологически активных пептидов.
Сравнение регионального распределения КПН и ФМСФ-ингибируемой КП показывает некоторое сходство, так максимальный уровень активности этих ферментов отмечен в гипофизе. Однако если активность ФМСФ-ингибируемой КП характеризуется высокими показателями в надпочечниках, где синтезируется большое количество энкефалинов, то для КПН эти значения на порядок ниже. Кроме того, различия в уровне активности ФМСФ-ингибируемой КП, обнаруженные между гипофизом и отделами мозга, менее значительны по сравнению с таковыми для КПН. Полученные данные позволяют выдвинуть предположение о некоторых различиях в биологической функции этих ферментов. Вероятно, что КПН и ФМСФ-ингибируемая КП участвуют в обмене разных регуляторных пептидов или в процессах модификации одних и тех же нейропептидов, но на различных этапах их обмена.
3.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ОСТРОГО ЭМОЦИОНАЛЬНО-БОЛЕВОГО СТРЕССА НА АКТИВНОСТЬ КПН, ФМСФ-ИНГИБИРУЕМОЙ КП И АПФ
Известно, что воздействие стресс-факторов вызывает значительные изменения в функционировании многих систем организма, таких как гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая (ГГНС), симпато-адреналовая (САС) и др. [5, 21, 76, 270]. Неотъемлемой частью развивающихся гормонально-медиаторных изменений при стрессе является активация пептидэргических систем головного мозга и периферических тканей [8, 91, 111, 137]. Одной из наиболее многофункциональных регуляторных систем, действующих в условиях стресса и адаптации, является система эндогенных опиоидных пептидов [116, 118, 242]. Обнаружено, в частности, что стресс-воздействие является стимулирующим фактором, приводящим к генерализованной активации стресс-лимитирующей энкефалинэргической системы [79, 100, 101]. Причем, наиболее выраженное повышение адаптивных способностей организма достигается при кратковременном остром воздействии стресс-факторов [144, 145]. В связи с этим, непродолжительное острое стрессирование рассматривается как физиологически адекватный способ изучения свойств эндогенных регуляторных пептидов при экстремальных воздействиях. Кроме того известно, что сильные раздражители, такие как электрический ток, резкий звук, вызывают повышение проницаемости ГЭБ для эндогенных биологически активных веществ, синтезируемых в ответ на стресс-воздействие [88, 97].
Практически не изучены ферментативные механизмы, обеспечивающие обмен регуляторных пептидов при остром ЭБС. Известно, что уровень нейропептидов при различных физиологических и патологических состояниях, а, следовательно, и степень реализации ответной реакции организма на оказанное воздействие, зависят от проявления функциональной активности ферментов их обмена. Участие КПН и АПФ в образовании и/или деградации энкефалинов, пептидных гормонов гипофиза и других регуляторных пептидов при стрессе сегодня не вызывают сомнений. Что же касается включения в процессы обмена нейропептидов ФМСФ-ингибируемой КП, то, на данный момент, это является только предположением. В связи с этим, для более детального определения биологической роли этого малоизученного фермента, особый интерес представляет сравнение изменений активности ФМСФ-ингибируемой КП с активностью КПН и АПФ при остром эмоционально-болевом стрессе (ЭБС). Большой интерес в связи с данными о длительном и фазном выбросе нейропептидов при воздействии стресс-факторов [134, 135, 144], вызывает изучение динамики изменения активности исследуемых ферментов.
Проведено исследование влияния острого ЭБС на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс через 0,5 часа, 4 часа, 24 часа, 72 часа и 10 суток после воздействия острого ЭБС. Сравнение активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ проводилось относительно интактной группы животных (норма). Результаты данной серии исследования представлены в таблице 2 (приложение).