Дальнейшее изучение механизмов, предотвращающих возникновении стресс-реакции, способствовало поиску новых веществ, обладающих стресс - протективным действием. Особое место в ряду таких веществ отводится транквилизаторам (резерпин, диазепам), которые широко используются в клинической практике. Однако влияние их на пептидэргические системы и ферменты обмена нейропептидов изучено недостаточно. Между тем этот вопрос достаточно важен, для понимания механизмов развития стресса.
Известно, что резерпин повышает уровень энкефалинов в организме [58]. При введении резерпина, активность ферментов процессинга, обладавших КПБ-подобной активностью (КПН и КПN), повышалась в 2-3 раза [58]. Предполагается, что изменение активности изучаемых ферментов является причиной активизации энкефалинэргической системы.
Транквилизаторы бензодиазепиновой природы также обладают стресс - протективным действием. Изучение их воздействия на ферменты обмена нейропептидов при стрессе становится тем более интересным, что в цепи реакций, которые они осуществляют в организме есть вещества, которые являются либо продуктами их деятельности, либо они участвуют в регуляции их синтеза. Так бензодиазепиновые транквилизаторы модулируют уровень АКТГ как в норме так и при воздействии стресс-факторов [114, 252], в частности введение фенозепама уменьшает концентрацию АКТГ при стрессе. Поскольку известно, что КПН участвует в биосинтезе АКТГ, то особый интерес представляет изучение возможности вовлечения этого фермента в стресс-протективное действие транквилизаторов.
Данные исследований показывают, что активность КПН при совместном воздействии диазепама и стресса, в основном, ниже, чем только при стрессе [39]. Активность АПФ в сыворотке при введении диазепама изменяется сходным образом. Поскольку АПФ участвует в деградации энкефалинов, вещества Р и ПВДС - биологически активных пептидов, основная роль которых заключается в адаптации организма к стрессу [107, 135, 152], то не исключается, что антистрессорное действие диазепама обусловлено его модулирующим действием на активность КПН и АПФ. Изменение активности данных ферментов может привести к уменьшению содержания АКТГ и увеличению содержания опиоидных нейропептидов, способствуя тем самым развитию адаптационных реакций в организме.
Таким образом, изменения в проявлении функциональной активности ферментов процессинга и инактивации биологически активных пептидов при стрессе свидетельствуют о важной роли этих ферментов в регуляции уровня активных нейропептидов, участвующих, как в развитии, так и в торможении размаха стресс-реакции.
Суммируя вышеизложенные сведения необходимо отметить следующее:
1. Опиоидные пептиды, их синтетические аналоги (например, даларгин), а также предшественники (лей5-энкефалин-арг6) обладают стресс-протективным свойством.
2. При воздействии на организм стресс-факторов различной природы наблюдаются значительные изменения в обмене биологически активных пептидов, а также жизнедеятельности организма в целом. Наиболее существенные изменения отмечаются при остром стресс-воздействии.
3. Важная роль в обмене регуляторных пептидов принадлежит ферментам пептид-гидролазам, которые регулируют уровень биологически активных пептидов при различных функциональных состояниях организма, в том числе и при стрессе. Особое место в ряду этих ферментов занимают основные карбоксипептидазы, которые действуют на конечном этапе процессинга предшественников регуляторных пептидов, а также ферменты, участвующие в инактивации активных форм нейропептидов.
4. Стресс-протективные вещества различной природы влияют на активность ферментов обмена нейропептидов мозга и периферических тканей стрессированных животных, что свидетельствует об изменениях в метаболизме нейропептидов у этих животных.
В связи с этим, представляет интерес изучение влияния предшественника лей-энкефалина на активность некоторых ферментов обмена нейропептидов головного мозга и периферических тканей животных, подверженных воздействию острого ЭБС. Полученные данные могут способствовать выяснению роли пептидгидролаз в механизмах развития стресс-реакции, а также в реализации эффектов экзогенного предшественника на организм, подверженный стрессу.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Объектом исследования служили головной мозг и периферические ткани (надпочечники и семенники) самцов белых беспородных крыс в возрасте 5 месяцев, массой 160-190 г. Животных содержали в стандартных условиях вивариума.
Животных декапитировали, извлекали головной мозг, гипофиз, надпочечники и семенники. Затем ткани помещали в охлажденный физиологический раствор, очищали от оболочек и кровеносных сосудов, высушивали фильтровальной бумагой. Затем выделяли отделы мозга - гипоталамус, средний мозг, гиппокамп, стриатум, большие полушария.
Образцы выделенных отделов мозга и тканей гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера в 20 мМ натрий ацетатном (NaAc) буфере рН 5,6, содержащем 50 мМ NaCl. Соотношения вес/объем были различны: 1/400- для гипофиза, 1/200- для надпочечников, 1/100- для семенников, 1/50- для отделов мозга. Гомогенаты использовали в качестве источников КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ.
В работе были использованы 4 группы животных. 1 группа – интактные животные. Животным 2 группы вводили раствор лей5-энкефалин-арг6 в дозе 20 мкг/кг соответственно. Животные 3 группы подвергались воздействию острого ЭБС. Животным 4 группы перед воздействием острого ЭБС инстиллировали на конъюнктиву глаза 2 мкл раствора предшественника лей-энкефалина - лей5-энкефалин-арг6 в дозе 20 мкг/кг.
2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.2.1. Схема введения предшественника лей-энкефалина
Введение предшественника лей-энкефалина - тир-гли-гли-фен-лей-арг (лей-энкефалин-арг) осуществлялось способом инстилляции на конъюнктиву глаза (доза 20 мкг/кг веса). Раствор лей-энкефалин-арг наносился на правый глаз крысы, с помощью дозатора с мягким катетером из поливинилхлорида (объем наносимого раствора 2 мкл). Введение предшественника энкефалина осуществлялось утром в одно и то же время.
Раствор лей-энкефалин-арг был приготовлен на физиологическом растворе.
Декапитацию животных производили через 0,5 часа, 4 часа, 24 часа, 72 часа и 10 суток после введения лей-энкефалин-арг, физиологического раствора и через 0,5 часа, 4 часа, 24 часа, 72 часа и 10 суток с начала воздействия острого ЭБС.
2.2.2. Моделирование острого эмоционально-болевого стресса
Для моделирования острого эмоционально-болевого стресса (ЭБС) крыс помещали в клетку с полом из металлической проволоки и встроенной в нее электрической лампочкой и звонком.
Для создания модели стресса крыс в течение 20 мин через каждые 10 секунд в беспорядочном режиме подвергали воздействию одного из трех факторов: вспышке света (лампа накаливания мощностью 100 Вт, расстояние 0,5 м), звука силой 70 Дб, электрокожному раздражению пороговой силы (2 мА). Длительность каждого воздействия составляла 1 сек.
2.2.3. Метод определения активности КПН.
Активность КПН определяли флюориметрически, используя метод Fricker и Snayder c некоторыми модификациями [193]. Активность фермента определяли по освобождению дансил-фен-ала из дансил-фен-ала-арг при рН 5,6, как активность ингибируемая ГЭМЯК - высокоспецифичным ингибитором КПН [193].
Для определения активности КПН смешивали 150 мкл 50 мМ NaAc буфера рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl (проба без ГЭМЯК - контрольная) или 150 мкл раствора, содержащего ГЭМЯК, в том же буфере – опытная проба (концентрация в пробе 1 мкМ) с 50 мкл препарата фермента. Затем пробы преинкубировали 8 мин, при 37 0С, по истечении этого времени прибавляли предварительно нагретый до 37 0С раствор дансил–фен–ала–арг (концентрация 210 мкМ), объемом 50 мкл (конечная концентрация субстрата в пробе 42 мкМ). Реакционную смесь инкубировали 60 мин при t = 37 0С, реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1 н. НСl.
К пробам приливали хлороформ объемом 1,5 мл. и тщательно встряхивали в течение 60 сек. При этом продукты реакции переходят в хлороформную фазу, а субстрат, нерастворимый в хлороформе, остается в водной фазе. Для разделения хлороформной и водной фаз пробы центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/ мин.
Флюоресценцию хлороформной фазы измеряли на флюориметре ФМЦ - 2 в кювете толщиной 1 см при lex = 360 нм и lem= 530 нм. В качестве стандартного раствора использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.
Активность КПН определяли как разность в накоплении продуктов реакции в пробах, содержащих и не содержащих ГЭМЯК. Активность выражали в нмоль дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.
2.2.4. Метод определения активности
ФМСФ – ингибируемой карбоксипептидазы.
Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы определялась флюориметрически, методом, разработанным в лаборатории нейрохимии ПГПУ им. В.Г. Белинского [49]. В качестве субстрата использовали раствор дансил-фен-лей-арг.
В контрольные пробы вносили 150 мкл 50 мМ NaAc буфера, содержащего 50 мМ NaCl рН 5,6 и 50 мкл препарата фермента. Опытные пробы содержали 140 мкл указанного буфера и 50 мкл препарата фермента, ингибитор фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), приготовленный на этаноле, вносился в пробу непосредственно перед преинкубацией в объеме 10 мкл. Пробы преинкубировали 8 мин при 370С, затем вносили 50 мкл 210 мкМ раствора дансил-фен-лей-арг. Далее контрольные и опытные пробы обрабатывали, как описано для КПН.