Белок холодового шока Bacillussubtilis, CSPB, после гипотермии влияет на уровень содержания нескольких других белков холодового шока в B. Subtilis. Экспрессия CSPB в Escherichiacoliпри 370C– в условиях, когда белки холодового шока CSPA и CSPBE. Coliне обнаруживаются – приводит к заметному снижению скорости роста клеток и имеет значительное влияние на уровень синтеза других белков. При этом происходит как уменьшение, так и увеличение уровне синтеза специфических белков. В частности, индукция CSPB приводит к усилению активности бета-галактозидазы, экспрессированной из слитых транскриптов hns-lacz. Это увеличение отражает индукцию транскрипции hns и синтеза HNS после холодового шока и invitroзависит от присутствия CSPA. Напротив, экспрессия мутантной формы CSPB, которая неспособна связываться с суперскрученной ДНК invitro, не имела влияния на степени увеличения экспрессии генов, уровня синтеза белка или активность бета-галактозидазы. Эти данные демонстрируют сильное влияние CSPB на синтез белка в E. Coliи предполагают аналогичную функцию для CSPA в E. Coliпо сравнению с CSPB в B. Subtilis. Однако впоследствии было установлено, что CSPA и CSPB по-разному связываются с одноцепочечной ДНК. В частности, в ходе этих исследований было установлено, что, если CSPB связывает поли-Т олигонуклеотиды примерно на порядок сильнее, чем поли-U или поли-С одноцепочечные ssДНК, тогда как CSPA связывает поли-Т, поли-U и поли-С ssДНК с одинаковой интенсивностью.
Как и другие бактерии, Bacillussubtilisобладает семейством гомологов небольших кислых белков, синтез которых индуцируется в ответ на холодовой шок. Делеция генов cspC или cspD не приводит к видимому изменению фенотипа; напротив, двойные мутанты по генам csp проявили серьезное снижение скорости клеточного роста как при 150C, так и при 370C и ухудшение выживаемости во время стационарно фазы роста. С помощью двумерного гель-электрофореза показано, что у двойных мутантов по генам csp разрегулирован синтез белка и потеря одного или двух белков CSP приводит к увеличению синтеза остаточных CSP при 370C и после холодового шока, что позволяет предположить, что CSP ингибируют синтез других членов этого семе ства белков. Тройной мутант cspB/C/Dмог размножаться только в присутствии CSPB, перенесенного плазмидой, что свидетельствует о том, что хотя бы минимальное количество гена csp необходимо для жизнеспособности B. Subtilis. После холодового шока синтез CSPB в 64bcdbt был намного ниже, чем в клетках дикого типа, что сопровождалось прекращением роста и значительным уменьшением общего синтеза белка. Поскольку как CSPB, CSPC, так и CSPD показали способность связывать РНК кооперативным и интерактивным способом, предполагается, что белки CSP действуют как РНК-шапероны, облегчающие инициирование трансляции при оптимальных и низких температурах.
При изучении характеристик CSPB было установлено, что CspB из Bacillussubtilisконформационно стабилен лишь в двух граничных состояниях, но чрезвыча но быстро меняет свою укладку между этими стабильными состояниями. Изучение соответствующих белков холодового шока из термофильно Bacilluscaldolyticusи гипертермофильно Thermotogamaritimaпоказало, что они обладают значительно более высоко конформационной стабильностью, но с неизменно очень быстро кинетико переходов между двумя стабильными состояниями. По-видимому, это неотъемлемое свойство небольших белков, полностью состоящих из изгибов.
В белке холодового шока CSPB из Bacillussubtilisимеются три незащищенных остатка фенилаланина, которые необходимы для его функционирования при связывании с одноцепочечными суперскрученными нуклеиновыми кислотами. Обычно гидрофобные боковые цепи фенилаланина в складчатых белках спрятаны. Авторами была предпринята попытка выяснить, может ли экспозиция этих остатков фенилаланина быть причиной низкой конформационной стабильности CSPB. В ходе экспериментов были измерены индуцированные мочевиной и индуцированные нагревом равновесные переходы для трех мутантов CspB, у которых Phe 15, Phe 17 и Phe 27 индивидуально были заменены аланином. Неожиданно было обнаружено, что все три мутации сильно дестабилизировали CspB. Таким образом, ароматические боковые цепи Phe 15, Phe 17 и Phe 27 в активном сайте важны и для связывания с нуклеиновыми кислотами, и для конформационной стабильности.
В целом, согласно современным представлениям, бактериальные белки холодового шока функционируют как регуляторы трансляции и РНК-шапероны. Во время роста при 370С CSP связываются с мРНК и поддерживают ее в лине но форме. Во время трансляции рибосомы вытесняют CSP с мРНК, поскольку CSP обладают более низким сродством к мРНК. Во время холодового шока происходит резкое увеличение содержания CSP, поскольку это необходимо для уравновешивания возрастания стабильности вторично структуры мРНК.
Искусственное снижение концентрации CSP приводит к образованию вторично структуры мРНК и прекращению процесса трансляции.
После резкого падения температуры различные виды бактерий проявляют мультигенный ответ. Доказательства такого рода ответа на действие холода у Salmonellatyphimuriumбыли получены при определении диапазона индуцируемых низкими температурами слияний генов, содержавших Mudlux-вставки. Из выделенных Mudlux-слияний генов было найдено одно, которое не производило детектируемого свечения во время выращивания при 300C, но проявило быстры и высоки уровень индукции при снижении температуры до 100C. Мишень данного слияния гена, как было показано, расположена по соседству с umudc опероном и кодирует гомолог основного белка холодового шока Escherichiacoli, CSPA. Изучение люминесценции показало, что детектируемое свечение происходило от слияния CspB: Mudlux при температурах ниже 220C, но не при более высоких температурах, даже после падения температуры от 300C. Более того, было обнаружено, что уровни содержания мРНК CSPB соответствуют данной модели люминесценции, что позволяет предлагать, что экспрессия cspB происходит ниже определенно пороговой температуры. Как было обнаружено, мРНК CSPB очень стабильна при 100C, но становится чрезвычайно нестабильно, когда температура поднимается выше порогово. Существующие клеточные РНКазы, таким образом, по-видимому, опосредуют разрушение мРНК CSPB при высоких температурах, но не способны совершать это при низких температурах.
Необходимо отметить, что белки холодового шока у мезофильных и термофильных бактерий имеют большое сходство в структуре, но весьма отличаются в стабильности. Сравнение структуры CSP из мезофилов и гипертермофильно бактерии Thermotogamaritimaпоказало большую значимость определенных заряженных групп белковой молекулы для ее стабилизации при низкой температуре.