Влияние антибиотиков на развитие микроорганизмов (стр. 3 из 3)
Ход работы:
1.Приготовили растворы антибиотиков.
1.1. 1000000 единиц соли бензилпенициллина (порошок) растворили в 10 мл стерильной дистиллированной воды. Получили концентрацию антибиотика 100000 ед. на 1 мл воды.
1.2. 0.5 г ампициллина растворили в 3 мл стерильной дистиллированной воды. Концентрация антибиотика – 0.66 г на 1 мл воды.
1.3. 1 г стрептомицина растворили в 6 мл стерильной дистиллированной воды. Концентрация антибиотика – 0.66 г на 1 мл воды.
2. Приготовили суспензии культур микроорганизмов: по одной петле культур B.cereus, B. subtilis и B. mesentericus внесли в пробирки с 9 мл стерильной воды.
3. В чашках Петри с застывшим питательным агаром стерильным скальпелем сделали по одному желобку вдоль всей чашки (ширина желобка 0.5 см, глубина агарового слоя 1 см). Желобки заполнили растворами антибиотиков (в каждом желобке по 0.6 мл соответствующего антибиотика).
4.В каждую чашку Петри с антибиотиком посеяли по три культуры бактерий в виде полосок, перпендикулярных к желобку. Выращивали при комнатной температуре двое суток.
5.Измерили диаметр зоны отсутствия роста микроорганизмов.
2.2.2 Метод титров (серийных разведений) в плотных средах
Цель: изучить влияние различных концентраций пенициллина и стрептомицина на рост представителя рода Bacillus – В. cereus.
Оборудование: стрептомицин и соль бензилпенициллина, суспензия культуры В. cereus, пробирки с 10 мл воды для разведений, стерильные пипетки на 1 мл, пробирки с 4 мл питательного агара, бактериологическая петля, спиртовка.
Ход работы:
1. Приготовление серийных разведений антибиотиков.
1.1. Растворили по 1000000 единиц стрептомицина и соли бензилпенициллина (1 г и 0.5 г порошка соответственно) в пробирках с 10 мл воды. Концентрация антибиотиков – 100000 ед./мл.
1.2. Из предыдущего разведения взяли стерильной пипеткой по 1 мл раствора каждого антибиотика и внесли в пробирки с 10 мл стерильной воды.
Концентрация антибиотиков – 10000 ед./мл.
1.3.По приведённой схеме (пункт 1.2.) приготовили разведения антибиотиков с концентрациями – 1000 ед./мл, 100ед./мл и 10 ед./мл.
2. Внесли стерильной пипеткой по 1 мл каждого разведения (10000 ед./мл, 1000 ед./мл, 100 ед./мл, 10ед./мл) в пробирки, содержащие по 4 мл расплавленной и охлаждённой агаризованной среды, скосили пробирки до застывания агара.
3. На поверхность плотной среды петлёй засеяли взвесь культуры B. cereus. Посевы выращивали 18-20 часов.
4. Отметили различную интенсивность роста микроорганизмов при разных концентрациях антибиотика.
Глава 3. Результаты исследований
В ходе курсовой работы изучили влияние таких антибиотиков, как стрептомицин, пенициллин, ампициллин, на грамположительные бактерии рода Bacillus: Bacillussubtilis, Bacillusmesentericus, Bacilluscereus.
Bacilluscereus образовал выпуклые колонии белого цвета с расползающимися краями, блестящие, слизистые; Bacillussubtilis – мутно-белые, слизистые, выпуклые колонии с расползающимися краями; Bacillusmesentericus – прозрачно-серые, плоские, блестящие, слизистые колонии с расползающимися краями.
В результате исследований методом диффузии в агар с использованием желобка получили следующие результаты:
1. В чашке Петри с бензилпенициллином наблюдали задержку роста колоний микроорганизмов, т. е. расстояние от края желобка до начала роста колоний. Задержка роста культуры, Bacillussubtilis составила 2 см, Bacillusmesentericus – 1.5 см, Bacilluscereus - 1 см. Результаты приведены на Рисунке 1 (Приложение 1).
2. Задержка роста при действии ампициллина составила: у Bacillussubtilis – 3.8 см, Bacillusmesentericus – 2.5 см, Bacilluscereus – 3.3 см. Результаты приведены на Рисунке 2 (Приложение 2).
3. В чашке Петри со стрептомицином задержка роста у Bacillussubtilis – 2.2 см, Bacillusmesentericus – 2 см, Bacilluscereus – 2.5 см.
При изучении влияния различных концентраций бензилпенициллина и стрептомицина на культуру Bacilluscereus (метод титров в плотных средах) получили следующие результаты:
1.В пробирках с различной концентрацией стрептомицина в питательной среде наблюдали неодинаковую интенсивность роста колоний. Отсутствием роста микроорганизмов характеризуется пробирка с добавлением антибиотика концентрацией 10000 ед./мл. Наибольшее развитие колоний наблюдали при концентрациях стрептомицина 10 ед./мл и 100 ед./мл (колонии ровные, распространены по всей поверхности питательной среды ). При концентрации антибиотика 1000 ед./мл, растворённой в 4 мл питательного агара, микроорганизмы развиваются отдельными скоплениями, колонии неровные, мелкие, распространены по питательной среде неравномерно.
2. Во всех пробирках с различной концентрацией бензилбенициллина в питательной среде наблюдали развитие колоний культуры Bacilluscereus. Интенсивность роста колоний увеличивается с уменьшением концентрации антибиотика. Наименьшее развитие и распространение микроорганизмов наблюдали в пробирке с концентрацией 10000 ед./мл, наибольшее – при концентрации 10 ед./мл, растворённой в 4 мл среды.
Выводы
1. Изучив чувствительность бактерий рода Bacillus к различным антибиотикам (пенициллин, ампициллин, стрептомицин), установили, что данные микроорганизмы наиболее чувствительны к ампициллину и стрептомицину, чувствительность к бензилпенициллину минимальна. Такую устойчивость к пенициллину можно объяснить возможностью некоторых представителей рода Bacillus (например, Bacillussubtilis и Bacilluscereus) образовывать фермент пенициллиназу, разрушающий пенициллин.
Что касается индивидуальной чувствительности, то наименее устойчивым к данным антибиотикам оказалась культура Bacillussubtilis. Bacillusmesentericus проявляет наибольшую устойчивость к стрептомицину и ампициллину, по сравнению с другими видами. К пенициллину самым устойчивым является Bacilluscereus.
2. В результате изучения влияния различных концентраций антибиотика, добавленного в питательную среду, на культуру Bacilluscereus, установили, что данный штамм устойчив даже к значительной концентрации бензилпенициллина (10000 ед./мл). Полученный результат доказывает возможность появления резистентности бактерий рода Bacillus к пенициллину, которая связана с образованием пенициллиназы.
Более чувствительным Bacilluscereus является по отношению к стрептомицину. Антибиотик концентрацией 10000 ед./мл, растворённый в 4 мл питательной среды полностью подавляет рост культуры, при концентрации 1000 ед./мл происходит угнетение роста, развитие минимальное.
Таким образом, стрептомицин оказывает большее влияние на бактерии рода Bacillus, чем пенициллин. Это объясняется широким спектром действия стрептомицина и тем, что многие чувствительные к пенициллину микроорганизмы относительно легко и быстро приобретают устойчивость к антибиотику.
Список литературы
1. Бриан Л. Бактериальная резистентность и чувствительность к химиопрепаратам / Перевод с англ. А. Я. Ивлевой. – Москва: Медицина, 1984.- 270 с.
2. Воробьев А. А., Кривошеин Ю. С., Быков А. С. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии. Москва: Мастерство, 2001.- 224 с.
3. Гусев М. В., Минеева Л. А. Микробиология (третье издание). Москва: Издательство Московского университета, 1992.- с.
4. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках (5-ое издание, переработанное и дополненное). Москва: Издательство Московского университета, 1994.- 512 с.
5. Ермольева З. В. Стрептомицин. Москва, Медгиз, 1956.- 59 с.
6. Гаузе Г. Ф. Лекции по антибиотикам (издание 2-ое, переработанное и дополненное). Москва, 1953.- 251 с.
7. Кашкин П. Н., Елинов Н. П. Антибиотики. Ленинград: Медицина, Ленинградское отделение, 1970.- 375 с.
8. Покровский В. Н. Антибиотики и бактерии. Москва: Знание, 1990. 64 с.
9. Сазыкин Ю. О. Биохимические основы действия антибиотиков на микробную клетку. Москва: Наука, 1965.- 267 с.
10. Шемякин Хохлов 1961
11. Дзержинская И. С. Методы выделения, исследования и определения антибиотической активности микроорганизмов, обладающих антагонистическими свойствами: Методические указания к практическим работам по дисциплине Антибиотики для студентов специальности 012400 «Микробиология» / АГТУ.– Астрахань, 2005.- 76 с.
Приложение 1
Рисунок 1. Чувствительность микроорганизмов (Bacillussubtilis, Bacillusmesentericus, Bacilluscereus – на рисунке слева направо) к бензилпенициллину.
Приложение 2
Рисунок 2. Чувствительность микроорганизмов (Bacillussubtilis, Bacillusmesentericus, Bacilluscereus – на рисунке слева направо) к ампициллину.
