Аффинные иммуносорбенты. Использование радиоактивных изотопов (стр. 2 из 2)
То есть кладут гель на лист толстой фильтровальной бумаги, постоянно смачиваемой буфером, а на диазобумагу накладывают стопку фильтровальной бумаги и через пластинку стекла прижимают грузом. Током жидкости, идущей вверх по капиллярам, часть белков из каждой полосы переносится на диазобумагу и там прочно фиксируется.
Неиспользованные диазогруппы между белковыми "репликами" закрывают вымачиванием в 10% -ном растворе этаноламина, который в отношениях с диазогруппой имитирует белок. Затем диазобумагу помещают в раствор полученной ранее антисыворотки и выдерживают 12 часов при 37°С.
За это время завершается реакция связывания специфических антител, имеющихся в антисыворотке с фиксированным на бумаге антигеном. (Для всех остальных белков в антисыворотке, - даже суммарной, - нет специфических антител) Оставшиеся свободными антитела отмывают буфером.
Наконец, диазобумагу, на которой имеется реплика искомого белка вместе со связавшимися с ним антителами, инкубируют 2 часа при 37°С в растворе меченого радиоактивным йодом белка А (он доступен в виде готового препарата).
Не сорбированный на "стержнях" антител белок А отмывают крепким солевым раствором. Бумагу сушат и методом авторадиографии (описанным в следующей главе) на рентгеновской пленке локализуют положение полосы искомого белка. Для последующего правильного совмещения пленки с диазобумагой (а через нее и с гелем), на бумаге перед авторадиографией делают две пометки радиоактивными чернилами.
Радиоактивные изотопы, используемые в биологии
Явление радиоактивного распада изучается в школьном курсе физики, и потому физическую природу радиоактивности мы здесь рассматривать не будем. Перечислю только те характеристики этого явления, которые существенны для дальнейшего изложения.
1. Известны три вида радиоактивного излучения: а, (3 и у. ос-частицы представляют собой ядра гелия; (З-частицы - это обычные электроны (Р-электроны) и у - очень коротковолновое электромагнитное изучение. В биологии используются только два последних вида.
2. Р-электроны испускаются ядрами атомов и потому химические свойства соответствующих радиоактивных изотопов (их валентности и химические связи) при этом не изменяются.
3. Интенсивность излучения любого радиоактивного препарата уменьшается со временем, поскольку уменьшается число атомов, способных к радиоактивному распаду в смеси с теми, в которых он уже произошел. Скорость этого уменьшения характеризуется так называемым временем полураспада (ТУ).
То есть временем, за которое любое данное количество изотопа (а с ним и интенсивность излучения) уменьшается вдвое. Очевидно, что эта характеристика остается неизменной в течение всего "периода жизни" этого изотопа. Время полураспада для различных изотопов колеблется в очень широких пределах.
Для изотопов, используемых в биологии, - от нескольких суток до нескольких тысяч лет (см. таблицу ниже). Знания величины ТУ очень существенно: в одних случаях даже при длительном хранении радиоактивного препарата интенсивность его излучения практически не изменяется, в других - она может упасть почти до нуля за пару недель.
4. Интенсивность излучения данного радиоактивного препарата в данный момент времени характеризуется числом радиоактивных распадов (актов излучения) в минуту. Его чаще всего выражают в единицах "Кюри" (Ки). Это - очень крупная единица.1Ки==2,2 1012 распадов в минуту.
Другая величина, принятая в системе единиц СИ, оказалась, напротив, слишком мала: 1 Беккерель (Бк) = 1 распаду в секунду. Поэтому до сих пор интенсивность предпочитают выражать числом милликюри (мКи) или микрокюри (мкКи).
5. Практический интерес представляет удельная радиоактивность (УА), т.е. радиоактивность 1 миллимоля радиоактивного вещества, в котором часть атомов уже претерпела радиоактивный распад. Кроме того, в подавляющем большинстве случаев истинно радиоактивные изотопы составляют лишь некоторую долю от общего числа атомов (или молекул) вещества, именуемого радиоактивным. УА выражают в единицах Ки/ммоль или мКи/ммоль.
6. Очень важной характеристикой радиоактивного излучения является энергия вылетающих частиц (у-излучение тоже происходит отдельными порциями энергии - "у-квантами"). И Р-электроны, и у-кванты, испускаемые различными атомами одного и того же радиоактивного препарата, могут иметь разные величины энергии.
В качестве характеристики изотопа принято указывать величину максимально возможной энергии соответствующих частиц или квантов. Ее выражают в "электронвольтах" (эВ) или килоэлектронвольтах (КэВ). Из курса физики известно, что 1эВ соответствует энергии, приобретаемой электроном при пролете в вакууме ускоряющего электрического поля с разностью потенциалов в 1 Вольт.
В нижеследующей таблице собраны все эти данные для изотопов, используемых в биологии.
| Изотоп | ТУз | УА (Ки/ммоль) | Энергия (КэВ) | |
| Р-электронов, Emax | у-излучения | |||
| "Н | 12,3 лет | 29 | 19 | - |
| 14^ | 5730 лет | 62 (мКи/ммоль) | 156 | - |
| 35g | 87,4 сут. | 1 500 | 167 | - |
| 32р | 14,3 сут. | 9 000 | 1708 | ,- |
| 125J | 60 сут. | 2 000 | 6 | 35 |
| 131J | 8 сут. | 16 000 | 250-810 | 80-720 |
(Цифра, стоящая слева вверху у химического символа изотопа, указывает его массу в единицах массы атома нормального водорода. Она может быть больше или меньше массы соответствующего нерадиоактивного атома. Объяснение этому - в курсе физики)
Иногда УА препарата выражают не в Кюри, а числом импульсов в минуту (имп/мин), которые регистрирует прибор, и относят не к миллимолю, а к миллиграмму или микрограмму вещества (имп/мин/мг). Строго говоря, это некорректно, так как включает сюда эффективность счета импульсов, которая может быть далеко не стопроцентной.
Но для сравнительных измерений, например, для наблюдения за ходом очистки индивидуального, радиоактивно меченого белка - вполне приемлемо. Кроме того, радиоактивность чаще всего используют для "детектирования" - отделения меченых препаратов определенной природы от таких же, но не меченых. Здесь эффективность счета не существенна.
Следует отдавать себе отчет в том, что указанные в таблице значения максимальной энергии полезны для сопоставления энергетических возможностей (прохождения через преграды) каждого из изотопов, но отнюдь не представляют энергию большинства реально испускаемых частиц или квантов.
Это хорошо видно из графиков распределения по энергиям электронов, представленных на рис. По осям абсцисс на этих графиках отложены величины энергии в КэВ, естественно, в разных масштабах (см. цифры). По осям ординат относительное содержание электронов указанной энергии. (Кривые не доходят до оси ординат, так как энергии электронов, близкие к нулю не поддаются измерению) Указанные значения Е соответствуют средней величине энергии электронов соответствующего изотопа, на которую следует ориентироваться при оценке возможностей их регистрации.
Рис. 2
Литература
1. Курашвили Л.В., Николаев П.Н. Диагностическая значимость исследования холестерина в ЛПВП у ожоговых больных. III Всесоюзная конференция по проблеме: Современные средства первой помощи и методы лечения ожоговой болезни /Тезисы/ - Москва, 1986. - С.186-187.
2. Курашвили Л.В., Савченко Р.П. Изменение показателей липидного обмена у больных с хронической почечной недостаточностью, находящихся на программированном гемодиализе /Лабораторное дело. - N 12. - 1986. - С.717-719.
3. Курашвили Л.В., Николаев П.Н. Новое в лабораторной диагностике ожоговых больных. Научно-практическая конференция, посвященная 140-летию областной больницы им.Н. Н. Бурденко и 110-летию со дня рождения академика Н.Н. Бурденко. Тез. докладов. - Пенза, 1986. - С.103-105