Опыты проводили на новорожденных, а также в возрасте 14, 28, 45, 120 суток после рождения, самках и самцах белых беспородных крыс. Животных содержали в стандартных условиях вивариума.
Животных декапитировали, извлекали головной мозг, гипофиз, надпочечники и половые железы. Ткани помещали в охлажденный физиологический раствор, очищали от оболочек и кровеносных сосудов, высушивали фильтровальной бумагой. Затем выделяли отделы мозга - гипоталамус и стриатум у всех крыс, а также четверохолмие, гиппокамп и большие полушария у животных в возрасте 120 суток.
Образцы выделенных тканей гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера в 20 мМ натрий ацетатном буфере (рН 5,6), содержащем 50 мМ NaCl, в соотношении 1:100 (вес:объем). Гомогенаты использовали в качестве источников КПН и ФМСФ-КП.
В качестве специфических ингибиторов применяли ФМСФ (”Serva”, США) и ГЭМЯК (“Serva”, США). В качестве субстратов использовали дансил-Phe-Ala-Arg и дансил-Phe-Leu-Arg. Все остальные реактивы были отечественного производства с квалификацией ”ХЧ” и ”ОСЧ”.
Для исследования онтогенетических изменений активности основных карбоксипептидаз при внутриутробном хроническом воздействии этанола использовали две группы животных: пренатально алкоголизированную (Э) и контрольную (К). Животные пренатально алкоголизированной группы являлись потомством самок, получавших в течение всего периода беременности в качестве единственного источника жидкости 12 % раствор этанола, содержащий 5 % сахарозы; контрольной группы – потомством самок, получавших в этот период только 5 % раствор сахарозы.
Кроме того, для исследования активности данных ферментов при последующей постнатальной алкоголизации крыс, подвергнутых влиянию этанола в эмбриональном периоде, взрослых животных каждой группы разделили на две подгруппы: постнатально алкоголизированную и контрольную. Животные постнатально алкоголизированной подгруппы получали в течение 15 суток в качестве единственного источника жидкости 12% раствор этанола, содержащий 5% сахарозы; крысы контрольной подгруппы – 5% раствор сахарозы. Таким образом, было сформировано четыре подгруппы взрослых животных: контрольная (КК), пренатально алкоголизированная (ЭК), постнатально алкоголизированная (КЭ), пренатально и постнатально алкоголизированная (ЭЭ).
Активность ферментов определяли флюорометрическим методом по Fricker L. D., Snyder S. H. [330].
Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (контрольная проба) натрий-ацетатного буфера или к смеси 140 мкл буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (опытная пробя). При определении активности ФМСФ-КП использовали ту же схему, с той лишь разницей, что в качестве ингибитора использовали 25 мМ спиртовой раствор ФМСФ, который добавляли после смешивания гомогената ткани с буфером.
Пробы преинкубировались 8 мин при 37оС.
Реакцию начинали прибавлением 50 мкл 210 мкМ субстрата – дансил-Phe-Ala-Arg для определения активности КПН или дансил-Phe-Leu-Arg для определения активности ФМСФ-КП (конечная концентрация субстратов в реакционной смеси составляла 42 мкМ). Далее пробы инкубировали 60 мин при 37оС. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1 М раствора соляной кислоты. Для экстракции продукта реакции – дансил-Phe-Ala или дансил-Phe-Leu – к пробам приливали 1,5 мл хлороформа и встряхивали в течение 60 с. Для разделения фаз пробы центрифугировали 5 мин при 1000 g. Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 в кювете толщиной 1 см при lex=360 нм и lem=530 нм. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-Phe-Ala в хлороформе.
Активность ферментов определяли как разность в накоплении продукта реакции в пробах, не содержащих и содержащих ингибитор, и выражали в нмоль дансил-Phe-Ala или дансил-Phe-Leu, образовавшихся за 1 мин инкубации, в пересчете на 1 мг белка.
Содержание белка в пробах определяли по методу Lowry и соавт. [244].
Взрослых животных в возрасте 120 дней однократно тестировали по методу «открытое поле» [73]. Для этого животных помещали на ярко освещенную площадку (100х100 см), разделенную на квадраты (20х20 см). В течение 5 минут оценивали следующие поведенческие параметры:
· количество посещений периферических квадратов;
· количество посещений центральных квадратов;
· суммарную двигательную активность (общее количество посещении периферических и цетральных квадратов);
· суммарную вертикальную активность (количество стоек);
· общую активность (суммарную двигательную и вертикальную активность);
Рассчитывали отношение суммарной двигательной к суммарной вертикальной активности.
Экспериментальные данные обрабатывали статистически. Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента [68]. Корреляционный и дисперсионный анализы проводили с помощью программы Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США) в режимах Simple Correlation, One-Way ANOVA и Multifactor ANOVA. Принадлежность подгрупп животных к разным гомогенным группам оценивали с помощью Multiplerangeanalysis(Statgraphics(версия 3.0) (“STSC, Inc.” США)). Принадлежность возрастных подгрупп к разным гомогенным группам проводили только в случае достоверности критерия Фишера. При этом оценивали количество гомогенных групп, образуемых экспериментальными подгруппами, с уровнем достоверности р<0,05. Баллы подгруппам присваивали на основании их принадлежности к разным гомогенным группам по мере увеличения среднего. При этом минимальный балл получала временная подгруппа с минимальным средним, максимальный балл – временная подгруппа с максимальным средним, а дробный балл (1,5) получали подгруппы, входящие одновременно в две гомогенные группы. На основании присвоенных баллов делали вывод о динамике изменения активности ферментов.
Согласно данным дисперсионного анализа пренатальное воздействие этанола достоверно влияло на активность КПН в стриатуме, надпочечниках и семенниках самцов, в гипоталамусе, стриатуме и надпочечниках самок (табл. 1).
Табл. 1. Дисперсионный анализ влияния пренатальной алкоголизации на активность КПН в тканях животных разного возраста (значения критерия Фишера FФ).
| Ткань | Самцы | Самки |
| FФ | ||
| Гипоталамус | 0,16 | 7,65** |
| Стриатум | 4,75* | 4,85* |
| Гипофиз | 1,78 | 0,00 |
| Надпочечники | 9,97** | 9,16** |
| Половые железы | 4,31* | 1,17 |
Примечание: здесь и в табл. 2-8, 11, 12: n= 5÷8; достоверность критерия Фишера * – р < 0,05, ** – р < 0,01, *** – р < 0,001.
При этом у самцов наблюдалось достоверное снижение активности КПН в стриатуме в возрасте Р0 и Р14 (рис. 1), в гипофизе в возрасте Р14, в надпочечниках в возрасте Р28 и Р120, в семенниках в Р0 и Р120 (рис. 2) по сравнению с интактными животными. У пренатально алкоголизированных самок наблюдалось достоверное снижение активности КПН в гипоталамусе в Р0, Р14, Р28, в стриатуме в Р14, Р45 (рис. 3), в гипофизе в Р0, в надпочечниках и яичниках в Р0 (рис. 4); увеличение активности в гипоталамусе (рис. 3) и в гипофизе в Р120 (рис. 4). Во всех остальных случаях изменений ферментативной активности не выявлено.
Наиболее существенные изменения активности КПН (40% – 50%) наблюдались в стриатуме, гипофизе, половых железах животных обоего пола и гипоталамусе самок на ранних этапах постнатального развития, а так же в надпочечниках самцов в Р28 и Р120, в семенниках в Р120, в гипофизе самок в Р120 (113%).
По данным дисперсионного анализа активность КПН достоверно зависела от возраста во всех тканях животных, кроме гипоталамуса самок (табл. 3) и семенников самцов алкоголизированных групп, а также гипоталамуса самцов контрольной и алкоголизированной групп (табл. 2).
Табл. 2. Дисперсионный анализ влияния возраста на активность КПН в тканях самцов крыс (значения критерия Фишера FФ, баллы возрастных групп).
| Ткань | Контрольные группы | Алкоголизированные группы | ||||||||||||
| FФ | Возрастные группы | FФ | Возрастные группы | |||||||||||
| n | 0 | 14 | 28 | 45 | 120 | n | 0 | 14 | 28 | 45 | 120 | |||
| Гипоталамус | 0,36 | 1,81 | ||||||||||||
| Стриатум | 7,90*** | 2 | 1 | 1,5 | 2 | 1 | 1 | 31,58*** | 3 | 1 | 2 | 3 | 2 | 2 |
| Гипофиз | 35,53*** | 4 | 1 | 2,5 | 4 | 3 | 2 | 11,52*** | 3 | 1 | 1,5 | 3 | 2,5 | 1,5 |
| Надпочечники | 12,72*** | 2 | 1 | 1 | 2 | 1 | 1 | 9,18*** | 3 | 3 | 2,5 | 2 | 1,5 | 1 |
| Семенники | 5,13** | 2 | 1,5 | 1,5 | 1 | 1 | 2 | 1,19 | ||||||
Табл. 3. Дисперсионный анализ влияния возраста на активность КПН в тканях самок крыс (значения критерия Фишера FФ, баллы возрастных групп).
| Ткань | Контрольные группы | Алкоголизированные группы | ||||||||||||
| FФ | Возрастные группы | FФ | Возрастные группы | |||||||||||
| n | 0 | 14 | 28 | 45 | 120 | n | 0 | 14 | 28 | 45 | 120 | |||
| Гипоталамус | 5,78** | 2 | 1,5 | 2 | 1,5 | 1,5 | 1 | 0,04 | ||||||
| Стриатум | 15,40*** | 3 | 1 | 3 | 2 | 2 | 1,5 | 11,93*** | 3 | 1 | 2 | 3 | 1,5 | 1,5 |
| Гипофиз | 12,54*** | 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 1 | 8,74*** | 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| Надпочечники | 33,83*** | 3 | 1,5 | 3 | 2 | 1,5 | 1 | 8,12*** | 2 | 1 | 2 | 1,5 | 1 | 1 |
| Яичники | 8,37*** | 3 | 2,5 | 3 | 1,5 | 1 | 1,5 | 12,97*** | 3 | 1,5 | 3 | 2 | 1 | 1,5 |
В стриатуме интактных самок (рис. 3) активность КПН значительно повышалась от Р0 к Р14, а затем постепенно снижалась к Р120 практически до исходного уровня. При пренатальной алкоголизации активность фермента постепенно повышалась от Р0 к Р28, а затем снижалась к Р45 – Р120 до уровня Р28.