Метиловые эфиры N-Dns-аминокислот. Для получения диазометана к 20 мл 40% КОН в 40 мл диэтилового эфира добавляли 3 г влажной нитрозометилмочевины и перемешивали на водяной бане со льдом в течении 15-20 мин. После окончания интенсивного газовыделения эфирный слой отделяли, промывали ледяной водой до рН 7.0, сушили безводным сульфатом натрия и использовали для обработки препаратов N-дансиламинокислот в составе культуральной жидкости или гидролизатов суммарных белков биомассы.
N-Cbz-аминокислоты. К 1.5 мл охлажденного до 00С раствора культуральной жидкости (50 мг) или белковых гидролизатов (4-5 мг) в 4 М NaOH добавляли порциями при перемешивании 2 мл 4 М NaOH и 28.5 мг бензилоксикарбонилхлорида. Реакционную смесь выдерживали при 00С, перемешивали 3 ч, подкисляли 2 М HCl до рН 3 и продукты экстрагировали этилацетатом (3 x 5 мл). Объединенный экстракт промывали водой до рН 7.0, сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст.
ТСХ производных аминокислот осуществляли на пластинках Silufol UV-254 (Чехо-Словакия) в системах растворителей: хлороформ-метанол-уксусная кислота, 10:1:0,3 (А) для N-Cbz-аминокислот и хлороформ-метанол-ацетон, 7:1:1 (Б) для метиловых эфиров N-Dns-аминокислот.
N-Cbz-аминокислоты детектировали по поглощению при 254 нм. Метиловые эфиры N-Dns-аминокислот детектировали по флуоресценции в УФ-свете.
Аналитическое и препаративное разделение смеси N-Cbz-аминокислот культуральной жидкости и белковых гидролизатов осуществляли методом обращённо-фазовой ВЭЖХ [31].
Метиловые эфиры N-Dns-аминокислот разделяли методом обращённо-фазовой ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосомKnauer, УФ-детектором 2563 и интегратором С-R 3A (Shimadzu, Япония). Использовали неподвижную фазу: Separon SGX C18; 18.7 мкм; 150 x 3.3 мм (Kova, Чехо-Словакия); система растворителей: (А) - ацетонитрил-трифторуксусная кислота, (20:80 об/об) и (В) - ацетонитрил. Использовали градиентное элюирование: от 0 до 20% В 5 мин, 20 до 100% В 30 мин, 100% В 5 мин, от 100 до 0% В 2 мин, 0% В 10 мин.
Ионнообменную хроматографию белковых гидролизатов осуществляли на приборе Biotronic LC 5001 (ФРГ); 230x 3,2 мм; рабочее давление 50-60 атм; скорость подачи натрий-цитратного буфера 18,5; нингидрина - 9,25 мл/ч; детекция при 570 и 440 нм (для пролина).
Секретируемый L-фенилаланин и L-лейцин определяли на приборе Beckman DU- 6 (США) при 540 нм, в образцах культуральной жидкости, объёмом 10 мкл после её обработки нингидрином.
Масс-спектры электронного удара производных аминокислот снимали на приборе MB-80 A (Hitachi, Япония) при ионизирующем напряжении 70 эВ.
СПИСОКЛИТЕРАТУРЫ.
1. Beaufrere B., Fournier V., Salle B., Putet G. // American Journal of Physiology. 1992. V. 263. ¹. 1. P. 214-220.
2. McIntosh L. P., Dahlquist F. W. // Quarterly Reviews of Biophysics. 1990. V. 23. P. 1-38.
3. Young V. R., Tu Y. M., Krempf M. //New techniques in nutritional research/ Ed. Whitehead R. G. New York. Academic Press. 1990. V. 9. P. 17-72.
4. Fesic S. W. & Zuiderweg E. R. // Quarterly Reviews of Biophysics. 1990. V. 23. ¹ 2. P. 97-131.
5. Haris P. I., Robillard G. T., Vandijk A. A., Chapman D. // Biochemistry. 1992. V. 31. ¹ 27. P. 6279-6284.
6. Rothschild K. J., Braiman M. S., Yi-Wu He., Marti T. and Khorana H. G. // J. of Biological Chemistry. 1990. V. 121. P.16985-16990.
7. Raap J., Winkel C., de Wit A. H. M., van Houten A. H. H., Hoff A. J., Lugtenburg J. // Anal. Biochem. 1990. V. 191. P. 9-18.
8. Stockman B. J., Reily M. D., Westler W. M., Ulrich E. L., Markley J. L. // Biochemistry. 1989. V. 28. P.230-236.
9. Ellman J. A., Volkman B. F., Mendel D. // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114. P. 7959-7961.
10. Redfield C. , Dobson C. M. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 122-136.
11. Zuiderweg E. R. P., McIntosh L. P., Dahlquist F. W., Fesik S. W. // J. Magn. Reson. 1986. V. 2. P. 210-216.
12. Hruby V. J. // J. Synth. and Appl. Isot. Labelled Compounds. 1985. V. 4. P. 287-292.
13. Berger A., Smolarsky M., Kurn N., Bosshard H. R. // J. Org Chem. 1973. V. 38. P. 457-460.
14. Raap J., Wolthuis W. N. E., Hehenkamp J. J. J., Lugtenburg J. // Amino Acids. 1995. V. 8. P. 171-186.
15. Lugwig S. N., Unkefer C. J. // J. Labelled Compd. Radiopharm. 1992. V. 31. P. 95-102.
16. van der Berg E. M. M., van Liemt J. H., Willem B. S. // Recl. Trav. Chim. Pays-Bas. 1989. V. 108. ¹ 9. P. 304-313.
17. McIntosh L. P., Griffey R. H., Muchmore D. C., Nielson C. P., Redfield A. G., Dahlquist F. W. // Proc. Natn. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 1244-1248.
18. Karnaukhova E. N., Reshetova O. S., Semenov S. Y.,Skladnev D. A., Tsygankov D. Y. // Amino Acids. 1994. V. 6. ¹ 2. P. 165-176.
19. Katz J. J., Crespi H. L. // Pure Appl. Chem. 1972. V. 32. P. 221-250.
20. Patel G. B., Sprott G. D., Ekiel I. // Applied and Environmental Microbiology. 1993. P. 1099-1103.
21. LeMaster D. M., Cronan J. E. // Journal of Biological Chemistry. 1982. V. 257. ¹ 3. P. 1224-1230.
22. LeMaster D. M. // Quarterly Reviews of Biophysics. 1990. V. 23. P. 133-174.
23. Мосин О. В., Карнаухова Е. Н., Пшеничникова А. Б., Складнев Д. А., Акимова О. Л. // Биотехнология. 1993. N. 9. С. 16-20.
24. Егорова Т. А., Мосин О. В., Ерёмин С. В., Карнаухова Е. Н., Звонкова Е. Н., Швец В. И. // Биотехнология. 1993. N. 8. С. 45-50.
25. Мосин О. В., Складнев Д. А., Егорова Т. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. 1996. ¹ 3. С. 3-12.
26. Stoeckenius W., Bogomolni R. A. // Annu. Rev. Biochem. 1982. V. 51. P. 587-616.
27. Первушин К. В., Арсеньев А. С. // Биоорганическая химия. 1995. Т. 21. ¹ 2. С. 83-111.
28. Steel J. C. H., Reynolds J. A. // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 1633-1638
29. Звонкова Е. Н., Зотчик Н. В., Филлипович Е. И., Митрофанова Т. К., Мягкова Г. И., Серебренникова Г. А. // Химия биологически активных природных соединений. М.: Химия, 1970. С.65-68.
30. Cohen J. S., Putter I. // Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 222. P. 515-520.
31. Egorova T. A., Eremin S. V., Mitsner B. I., Zvonkova E. N., Shvets V. I. // Journal of Chromatography B. 1995. V. 665. P. 53-62.
32. Daniely B. // J. Org. mass spectrometry. 1989. V. 24. P. 225-229.
33. Физер Л. Ф., Физер М. // Реагенты для органического синтеза. М.: Мир, 1971. Т. 2. С. 92.
34. Griffiths D. V., Feeney J., Roberts G. C., Burgen A. S. // Biochim. et Biophys. Acta. 1976. V. 446. P. 479-585.
35. Matthews H. R., Kathleen S., Matthews K. and Stanley J. // Biochim. et Biophys. Acta. 1977. V. 497. P. 1-13.
36. Miller J. H. // Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1976. P. 393.
37. Oesterhelt D., Hess B. // Eur. J. Biochem. 1973. V.37. ¹.1. P. 316-326.
38. Tokunada F., Ebrey T. // Biochemistry. 1978. V.17. ¹.10. P. 1915-1922..
39. Oesterhelt D., Stoeckenius W. // Methods Enzymol. 1974. V. 31. P. 660-668.
40. Bligh E. G., Dyer W. J. // Can. J. Biochem. Physiol. 1959. V. 37. ¹. 8. P. 911-918.
41. Мосин О. В., Егорова Т. А., Чеботаев Д. В., Складнев Д. А., Юркевич А. М., Швец В. И. // Биотехнология. 1996. ¹ 4. С. 27-32.
MASS-SPECTROMETRY EVALUATION OF 2H AND 13C ENRICHMENT LEVELS OF AMINO ACIDS, OBTAINED FROM BACTERIAL OBJECTS
O.V.MOSIN
M. V. Lomonosov State Academy of Fine Chemical Technology, Moscow, 117571
The high-sensitive method of electron impact mass-spectroscopy was employed for evaluation of 2H and 13C enrichment levels of secreted amino acids of methylotrophic bacteria Brevibacterium methylicum and Methylobacillus flagellatum, and amino acid resigues of total protein obtained from media contaning as a sourse of stable isotopes (2H)methanol, (13C)methanol and 2H2O. The incorporation of L-[2,3,4,5,6-2Н]phenylalanine, L-[3,5-2Н]tyrosine and L-[2,4,5,6,7-2Н]tryptopan in bacteriorhodopsin synthesised in membrane of halophilic bacterium Halobacterium halobium ET 1001 was also made. For mass-spectrometric analysis the multicomponential mixures of amino acids, derived from cultural media and protein hydrolysates after hydrolysis in 6 M 2HСl (3% phenol) and 2 M Ва(OH)2 were modified to N-benzyloxycarbonyl-derivatives of amino acids as well in methyl esters of N-dansyl-derivatives of amino acids which were preparative separated using a method of reverse-phase high column liquid chromatography (HCLP). [2H]- and [13C]amino acids obtained represented the mixures differing in quantities of isotopes incorporated into molecule. The levels of 2H and 13С enrichment of secreted amino acids and amino acid resigues of protein were found to vary from 10% to L-leucine/isoleucine up to 97.5% for L-alanine depending on concentration of labelled substrates.