Масс-спектрометрическая оценка уровня включения дейтерия и углерода-13 в молекулы аминокислот бактериальных объектов (стр. 3 из 5)
Для штамма B. methylicum наблюдалось специфическое возрастание уровней изотопного включения дейтерия в молекулы индивидуальных аминокислот культуральных жидкостей (табл. 2) при ступенчатом увеличении концентраций 2Н2O в ростовой среде. Уровни включения дейтерия в молекулы разных аминокислот при одинаковых условиях культивирования различаются. Такой результат зафиксирован во всех экспериментах, где источником стабильных изотопов служила 2Н2О.
Из масс-спектра метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот культуральной жидкости, полученной со среды, содержащей 49% 2Н2О (рис. 3 б) видно, что молекула фенилаланина содержала 6 изотопнозамещённых форм со средним значением m/z 414.2, которое возрастает по сравнению с контрольными условиями (m/z 412.0, рис. 3 а) на 2.2 единицы, т. е. 27.5% от общего количества атомов водорода в молекуле замещены на дейтерий. Область масс-спектра со значениями m/z 90-300 соответствует продуктам дериватизации метаболитов ростовой среды. Пик с m/z 431.0, зафиксированный в масс-спектре культуральной жидкости и проявляющийся во всех опытах, соответствует продукту дополнительного метилирования фенилаланина по a-NH-(Dns)- группе. Пик с m/z 400 (рис. 3 б) вероятнее всего отвечает продукту отщепления метильной группы от дейтерированного производного фенилаланина.
Присутствие в масс-спектре образца культуральной жидкости B. methylicum, полученной на среде с 73.5% 2Н2О (рис. 4) пика молекулярного иона метилового эфира N-Dns-фенилаланина с m/z 416.1 указывает на увеличение молекулярной массы фенилаланина на 4.1 единицу, т. е., 51.2% атомов водорода в молекуле фенилаланина в этом случае замещены на дейтерий. Очевидно, что вышеобозначенные атомы дейтерия включились в молекулу фенилаланина за счет процесса биосинтеза de novo, т. е. по углеродному скелету молекулы. К легко обмениваемым следует отнести протоны (дейтероны) при гетероатомах в NH2-и СООН- группах аминокислот, которые замещаются за счёт лёгкости диссоциации в Н2О (2Н2О).
Таблица 2
Уровни включения 2Н и 13С в молекулы аминокислот, секретируемых в культуральную жидкость (КЖ) B. methylicum и M. flagellatum, и в аминокислотные остатки белков (данные получены для метиловых эфиров N-Dns-аминокислот и N-Cbz-аминокислот)
     Аминокислоты | Содержание 2Н2О в среде, %* 24.5 49.0 73.5 98.0КЖ белок КЖ белок КЖ белок КЖ белок | 1%13СН3ОН**КЖ белок | ||||
| Глицин | - 15.0 | - 35.0 | - 50.0 | - 90.0 | 60.0 90.0 | |
| Аланин | 24.0 20.0 | 37.5 45.0 | 62.5 62.5 | 77.5 97.5 | 35.0 95.0 | |
| Валин | 20.0 15.0 | 46.3 36.3 | 43.8 50.0 | 58.8 50.0 | 50.0 50.0 | |
| Лейцин/изолейцин | 15.0 10.0 | 47.0 42.0 | 46.0 45.0 | 51.0 49.0 | 38.0 49.0 | |
| Фенилаланин | 15.0 24.5 | 27.5 37.5 | 51.2 50.0 | 75.0 95.0 | 95.0 80.5 | |
| Тирозин | - 20.0 | - 25.6 | - 68.8 | - 92.8 | - 53.5 | |
| Серин | - 15.0 | - 36.7 | - 47.6 | - 86.6 | - 73.3 | |
| Аспарагиновая кислота | - 20.0 | - 36.7 | - 60.0 | - 66.6 | - 33.3 | |
| Глутаминовая кислота | - 20.0 | - 40.0 | - 53.4 | - 70,0 | - 40.0 | |
 Лизин | - 10.0 | - 35.3 | - 40.0 | - 58.9 | - 54.4 | |
Из табл. 2 видно, что условиях ауксотрофности по L-лейцину уровни включения 2Н в молекулы лейцина/изолейцина ниже, чем для фенилаланина. Отмеченная особенность отчётливее всего проявляется на среде с максимальной концентрацией 2Н2О. Ещё раз этот результат подтвердили рис. 5, где показан масс-спектр [2Н]аминокислот культуральной жидкости в виде метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот после выращивания бактерий B. methylicum в указанных условиях. Видно, что величина m/z 418.0 пика молекулярного иона метилового эфира N-Dns-фенилаланиа увеличивается по сравнению с контрольными условиями на 6 единиц, что соответствует замещению 75% от общего количества атомов водорода в молекуле. В отличие от фенилаланина уровень включения дейтерия в лейцин/изолейцин составил 51.0%, а в валин - 58.8%. Примечательно, что в масс-спектре этого образца фиксируется пик обогащённого дейтерием бензильного фрагмента при m/z 97.0 (вместо m/z при 91.0 в контроле), что указывает на частичную локализацию атомов дейтерия в молекуле фенилаланина в положениях С2-С6 ароматического кольца и сопредельном с ними положении при углеродном атоме b. Несмотря на то, что в остальных опытах пики бензильных фрагментов не были зафиксированы, логично предположить, что при других концентрациях 2Н2О дейтерий также включается в ароматическое кольцо фенилаланина, так как в 2Н2О метаболизм у штамма B. methylicum не претерпевает существенных изменений [25].
Аналогичная закономерность в уровнях включения 13С в молекулы аминокислот, связанных с ауксотрофным метаболизмом, проявляется при выращивании L-изолейцинзависимого штамма M. flagellatum на среде с 1% (13С)метанолом. Как видно из табл. 2, в отличие от наблюдаемого для [13С]фенилаланина (уровень изотопного включения - 95.0%), уровни включения изотопа 13С в молекулы лейцина/изолейцина, аланина и валина составили 38.0; 35.0; 50.0% соответственно. Уровень изотопного включения для [13C]глицина (60%) хотя и выше, чем для трёх последних аминокислот, но намного ниже, чем для фенилаланина.
Суммируя полученные данные по уровням включения 2Н-и 13С в молекулы секретируемых аминокислот, можно сделать вывод о сохранении минорных путей метаболизма, связанных с биосинтезом лейцина и метаболически родственных с ним аминокислот de novo. Другим логическим объяснением наблюдаемого эффекта, если принять во внимание происхождение лейцина и изолейцина по различным путям биосинтеза, может быть ассимиляция клеткой немеченого лейцина из среды на фоне биосинтеза меченого изолейцина de novo. Учитывая данные эффекты следует подчеркнуть, что использование ауксотрофных форм микроорганизмов для получения изотопномеченых аминокислот не оправдывает себя практически из-за множественного включения изотопов в молекулы. Напротив, использование для этих целей прототрофных форм микроорганизмов кажется более перспективным.
Общие принципы изучения уровней изотопного включения в молекулы аминокислот при данном способе введения метки были продемонстрированы на примере анализа сложных мультикомпонентных смесей, полученных после гидролиза суммарных белков биомассы метилотрофных бактерий, а также индивидуального белка – бактериородопсина, выполняющего роль АТФ-зависимой транслоказы в клетках галофильной бактерии Halobacteriumhalobium. Как видно из рис. 6, до десяти аминокислот могут быть идентифицированы в гидролизате белка B. methylicum по пикам молекулярных ионов метиловых эфиров их N-Dns-производных аминокислот.
Как и в случае с секретируемыми аминокислотами, пики М+. соответствовали смесям изотопнозамещённых форм аминокислот. Для лизина и тирозина пики М+. соответствовали метиловым эфирам ди-производных аминокислот - a, e-ди-Dns-лизину (с М+. при m/z 631.0) и О, N-ди-Dns-тирозину (с М+. при m/z 663.9). Уровни изотопного включения дейтерия в молекулы аминокислот при содержании 2Н2O в ростовой среде 49% варьируют от 25.6% для тирозина до 45.0% для аланина (рис. 6 б и табл. 2). В молекулах глицина, валина, фенилаланина, серина, лизина, аспарагиновой и глутаминовой кислот они находятся в пределах 35 - 40%. Что касается других аминокислот, не детектируемых данным методом, очевидно, что уровни изотопного включения в них приблизительно такие же. Это подтверждается данными по разделению белковых гидролизатов метилотрофных бактерий методами обращённо-фазовой ВЭЖХ в виде N-Cbz-производных аминокислот или метиловых эфиров их N-Dns-производных аминокислот и ионнообменной хроматографии, где детектируется уже 15 аминокислот (см., например, рис. 7).