МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ
КАФЕДРА ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ И БИОТЕХНОЛОГИИ
Курсовая работа
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ В ИССЛЕДОВАНИИ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ
студентка IIIкурса
Н.А. Толстоноженко
Красноярск 2008
СОДЕРЖАНИЕ
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Явление флуоресценции
1.2 Развитие флуоресцентной микроскопии
1.3 Флуорохромы и флуорохромирование
Глава 2. Объекты и методы исследования
2.1 Объекты флуоресцентной микроскопии
2.2 Возможности флуоресцентной микроскопии
Глава 3. Использование метода люминесцентной микроскопии в исследовании микроводорослей
3.1 Выявление физиологического состояния клеток микроводорослей
3.2 Количественная регистрация интенсивности флуоресценции
3.3Оценка степени токсичности отдельных веществ для водорослей
3.4Определение содержания витаминов в растительных клетках
Заключение
Список литературы
Summary
ВВЕДЕНИЕ
Функционирование и роль микроводорослей в различных экосистемах определяется широкими адаптационными способностями, которые включают изменение структурных и физиологических свойств фотосинтетического аппарата.
Изучение модельных систем естественного фитопланктона позволяет решить ряд теоретических проблем в области исследований фотосинтеза, а также имеет практическое значение для прогнозирования развития водорослей при возрастающей антропогенной нагрузке.
Флуоресцентные характеристики фитопланктона используются для оперативного определения концентрации хлорофилла, на основе которой рассчитывается биомасса и продуктивность водорослей. Измерение концентрации хлорофилла позволяет получить сведения о фотосинтетической активности микроводорослей. [14]
В настоящее время метод флуоресцентного анализа выступает в качестве методической основы решения двух крупных проблем: интеграция биологических (растительных) систем и организация мониторинга.
Преимущество люминесцентной микроскопии, как одного из флуоресцентных методов исследования, заключается в том, что информацию о состоянии фотосинтетического аппарата и отдельных клеток можно получить за очень короткий срок при относительно малом объёме проб. [10]
Целью работы является изучение метода люминесцентной микроскопии для исследования состояния микроводорослей.
В задачи работы входило:
1. Ознакомиться с особенностями люминесцентной микроскопии, местом её среди флуоресцентных методов исследования.
2. Изучить методику выявления физиологического состояния и оценки степени токсичности отдельных веществ для клеток микроводорослей с помощью люминесцентной микроскопии.
3.Изучить методику определения содержания нефлуоресцирующих веществ – витаминов – в растительных клетках с помощью исследуемого метода.
4. Изучить методику количественной регистрации интенсивности флуоресценции методом люминесцентного микроскопирования.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Явление флуоресценции
При взаимодействии света с веществом может происходить преломление световых лучей и их рассеяние, либо поглощение фотонов молекулами, или то и другое вместе. Если произошло поглощение кванта света, то через 10-9с может происходить испускание части поглощённой энергии в виде кванта света с большей длиной волны: такое излучение называется люминесценцией. Встречающиеся в природе явления люминесценции весьма разнообразны. [5]
Различают два вида люминесценции, отличающихся по времени жизни и энергии излучаемых фотонов. Исходя из наиболее характерного качественного признака люминесценции – степени её длительности – различают флуоресценцию – свечение мгновенное, появляющееся лишь в момент возбуждения светящегося объекта, и фосфоресценцию – свечение более длительное, продолжающееся иногда весьма долго по окончании возбуждения. Изучение люминесценции позволяет судить о строении поглощающих свет молекул и участков молекул (хромофоров), а также производить их качественный и количественный анализ, выяснять физико-химические свойства среды, окружающей молекулы или их хромофорные группы. [6]
Различают собственную (первичную) люминесценцию, наблюдаемую без окрашивания, и вторичную (наведённую), которая возникает после обработки химическим агентом или красителем. [9]
Согласно закону Стокса, спектр флуоресценции лежит в более длинноволновой области по сравнению со спектром поглощения того же соединения. Это означает, что средняя энергия квантов флуоресценции меньше средней энергии поглощённых квантов.
Правило Каши относится к форме спектра флуоресценции при возбуждении объекта светом разных длин волн. Испускание квантов флуоресценции всегда происходит с нижнего возбуждённого уровня молекул, независимо от того, на каком уровне оказался электрон в результате поглощения. Т.е. какой бы длиной волны не была возбуждена молекула, излучение будет происходить из одного и того же состояния молекулы. [7]
Интенсивность флуоресценции (Iф) зависит от концентрации флуоресцирующих молекул (Z), интенсивности возбуждающего света (Iв), значение молярного коэффициента поглощения (Еλ) и величины квантового выхода флуоресценции
(Кλ): Iф=2,3*Iв* Еλ* Кλ* Z*L,
где L – длина оптического пути в объекте. Измеряемая интенсивность флуоресценции даёт информацию о величине Кλ*Z, т.е. о количестве флуоресцирующих молекул и их способности флуоресцировать (квантовый выход). Это уравнение справедливо при поглощении объектом менее 5% возбуждающего света, что обычно имеет место в физиологических опытах. При поглощении более 5% света наблюдается нелинейная зависимость. [8]
Для характеристики флуоресценции помимо её интенсивности и квантового выхода, можно использовать значения смещения максимума флуоресценции по спектру, время жизни флуоресценции молекулы и степень поляризации флуоресценции. Перечисленные параметры позволяют получить информацию о характере взаимодействия флуоресцентных молекул между собой и с окружающей их средой. [6]
1.2 Развитие флуоресцентной микроскопии
Люминесцентная микроскопия – метод микроскопии, позволяющий наблюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур, входящих в их состав.
Цвет люминесценции, т.е. длина волны излучаемого света зависит от химической структуры и от физико–химического состояния микроскопируемого объекта, что и обуславливает возможность использование люминесцентной микроскопии в целях микробиологической и цитологической диагностики, для дифференцирования отдельных компонентов клеток. Первичная люминесценция присуща ряду биологически активных веществ, таких, как ароматические аминокислоты, порфирины, хлорофилл, витамины А, В2, В1, некоторые антибиотики (тетрациклин) и химиотерапевтические вещества (акрихин, риванол). Вторичная, или наведённая, люминесценция возникает в результате обработки микроскопируемых объектов флюоресцирующими красителями – флюорохромами, что позволяет проводить люминесцентно–цитологический и люминесцентно–цитохимический анализ. [16]
В истории развития люминесцентной микроскопии выделяют несколько этапов, связанных с усовершенствованием методики.
Люминесцентная микроскопия появилась в начале прошлого века как разновидность ультрафиолетовой микроскопии. В 1910 году А. Кёллер доказал принципиальную возможность создания люминесцентного микроскопа. В 1911 г. изобретён люминесцентный микроскоп, который был использован русским ботаником М.С. Цветом для изучения люминесценции хлорофилла растительных клеток. Прогресс люминесцентной микроскопии в дальнейшем был связан с введением в практику флуоресцентных красителей, так называемых флуорохромов, которые были разработаны Хайтингером и его сотрудниками в 1935 году. Применение сильно разбавленных растворов флуорохромов, избирательно связывающихся с определёнными структурами клеток, и прежде всего акридинового оранжевого, было введено Штруггером в 1940 году. Происходило и усовершенствование аппаратуры (разработка метода возбуждения люминесценции падающим светом через объектив микроскопа с использованием интерференционной светоделительной пластинки), разработка новых люминесцентно-цитохимических методов, изысканием новых областей её применения, нашедших широкое применение в микробиологии, иммунологии и других областях медико–биологических исследований.
В настоящее время различают несколько типов люминесцентной микроскопии в зависимости от характера освещения.
При освещении объекта проходящим светом (обычный путь освещения) имеют дело со светопольной люминесцентной микроскопией.
Замена светопольного конденсора конденсором тёмного поля даёт возможность осуществить люминесцентную микроскопию в тёмном поле (люминесцентная ультрамикроскопия).
В случае освещения объекта сверху - имеют дело с люминесцентной микроскопией в падающем (отражённом) свете. [11]
1.3 Флуорохромы и флуорохромирование
У подавляющего большинства биологических объектов их собственная неяркая люминесценция не позволяет проводить люминесцентно-микроскопические исследования и для избирательного выявления определённых структур применяют люминесцентные красители - флуорохромы. Некоторые из этих красителей диффузно распределяются в клетках, другие избирательно связываются с определёнными структурами клеток или даже с определёнными химическими веществами.
Известно несколько десятков органических соединений, с успехом используемых в качестве флуорохромов. К ним относятся красители: тиазоловые, хинолиновые, азокрасители и особенно акриловые производные. Хорошими флуорохромами являются некоторые естественные пигменты (хлорофилл, липохромы), алкалоиды (берберин, хинин), углеводороды (бензпирен, дибензаантрацен). Флуорохромы применяются в сильно разведённых водных или спиртовых растворах (от 1:1000 до 1:100000). Углеводороды (бензипрен) растворяют в насыщенном водном растворе кофеина.