ЯМР-спектроскопия нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов (стр. 1 из 3)

Реферат

на тему:

«ЯМР-спектроскопия нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов»

Введение

Наряду с протеинами существуют и другие макромолекулы, которые выполняют важные биологические функции. Большинство методов ЯМР, используемых для исследования протеинов, могут быть при этом непосредственно перенесены на другие макромолекулы. В этой работе рассмотрим характерные особенности применения метода ЯМР для исследования нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов.

1. Состав и структура нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты занимают ключевую позицию в процессах хранения и передачи информации о наследственных свойствах организма. Как и протеины, они являются линейными макромолекулами, состоящими из небольшого числа различных фрагментов, нуклеотидов.

ЯМР нуклеиновых кислот в принципе сталкивается с теми же проблемами, что и ЯМР протеинов. В то же время определение пространственной структуры нуклеиновых кислот является более простой задачей, так как здесь выбор основной пары нуклеотидов существенно ограничивает число возможных пространственных структур.

Основными фрагментами дезоксирибонуклеиновых кислот являются дезоксирибонуклеотиды, а основными фрагментами рибонуклеиновых кислот – рибонуклеотиды. По аналогии с аминокислотами в протеинах эти фрагменты отличаются только своими боковыми цепями, которые в ДНК в основном состоят из пиримидиновых производных – цитозина и тимина – и пуриновых производных – аденина и гуанина. В РНК присутствуют те же боковые цепи, только основание тимин заменено на урацил. Кроме этих основных фрагментов нуклеиновых кислот имеется еще небольшое количество производных этих оснований – так называемые редкие основания.

ДНК представляет собой двойную спираль, образованную двумя переплетающимися нитями. Она может существовать в нескольких различных формах, значение которых для процессов регуляции и контроля передачи наследственной информации в дальнейшем будет подробно обсуждаться. РНК, как правило, существует в виде мономера. Основными формами РНК являются матричная РНК, транспортная РНК и рибосомная РНК. Как ДНК, так и РНК вступаете разнообразные взаимодействия с протеинами, в результате чего происходит либо считывание информации, либо ее регуляция. Дополнительно ДНК в эукариотических клетках образуют ассоциаты с протеинами: гистонами, которые участвуют в строительстве хромосом. Подобные взаимодействия демонстрируют РНК, например рРНК связывается с протеинами, из которых состоят рибосомы. В процессах расшифровки и передачи информации мРНК и тРНК вступают в разнообразные взаимодействия с ферментами, участвующими в этих процессах. Поэтому ясно, что исследование взаимодействий между протеинами и нуклеиновыми кислотами является одной из самых интересных областей применения метода ЯМР к биологическим задачам.

2. Исследование методом ЯМР нуклеиновых кислот и комплексов нуклеиновых кислот с протеинами

Применение метода ЯМР к исследованию нуклеиновых кислот обладает рядом особенностей по сравнению с исследованием протеинов. Так как основу нуклеотидов составляют ароматические системы, то имеет место достаточно сильная зависимость химических сдвигов от конформации молекул, что приводит к значительному усложнению спектров ЯМР. Основным фрагментом в последовательности нуклеиновых кислот является фосфатный остаток, так что ЯМР ³¹С наряду с ЯМР З может быть использован в качестве достаточно чувствительного метода исследований. Ионы Mg²⁺ связываются с тРНК и стабилизируют структуру. На рис.3.40 показан пример спектра ³¹Р тРНК при различных концентрациях Mg.

В спектре С наблюдаются хорошо разрешенные линии, положение которых изменяется в зависимости от концентрации. Даже в одномерном спектре ЯМР *Н можно достаточно четко различить отдельные линии всех протонов иминогрупп, взаимодействующих между собой, и провести их отнесение. Эти протоны имеют более важное значение для определения структуры, так как именно их взаимодействие играет основную роль при определении структуры нуклеиновых кислот.

Последовательное отнесение резонансных линий и расчет трехмерной структуры проводят теми же методами, что и при исследовании протеинов. В принципе нуклеиновые кислоты могут принимать разнообразные формы. Главная цепочка фрагмента всегда характеризуется значениями шести торсионных углов, один из которых располагается в плоскости кольца рибозы, а значит, обладает ограниченной областью значений, которая зависит от четырех эндоциклических торсионных углов. Положение основания относительно рибозы определяется одним торсионным углом в гликозидной связи. Внутри рибозы спины всех протонов связаны косвенным спин-спиновым взаимодействием. Это означает, что отнесение резонансных линий, принадлежащих рибозному остатку, может быть проведено по методу COSY. Для основания константы косвенного спин-спинового взаимодействия, как правило, невелики, так что с ростом молекулярной массы основания их далеко не всегда удается зафиксировать. Внутри основания констаиты косвенного спин-спинового взаимодействия дают неполную информацию, поэтому следует дополнительно использовать ЯЭО. В отличие от протеинов отдельные фрагменты связаны скалярным взаимодействием через фосфатные группы, и в данном случае для расшифровки структуры можно воспользоваться значением константы гетероядерного косвенного спин-спинового взаимодействия ¹З– ³¹С.

Анализ структуры резонансных линий в спектрах ³¹С фосфатной группы показывает, что имеется взаимодействйе.фосфора с протоном в положении 3', с протоном в положении 5' СН₂-группы и 4' – протоном дезоксирибозы. Это означает, что проведя отнесение в спектре линии, соответствующей атому фосфора, связанному с этим протоном, можно найти линию, соответствующую протону в положении 4' следующего остатка. Правильность отнесения можно проверить, определив, какая из линий соответствует линии протона в положении 5'. Спектр З– ³¹Р – ^JH, полученный по методу RCT, позволяет отнести линии, соответствующие протонам в положениях 3' и 4', которые принадлежат двум соседним кольцам дезоксирибозы.

Информация, получаемая из значений констант спин-спинового взаимодействия и ЯЭО, отчасти является избыточной, так что спиновая система нуклеозида может быть определена достаточно надежно. Наряду с этим имеются зависящие от пространственной структуры данные по ЯЭО для последовательности, исходя из которых можно идентифицировать соседние нуклеотиды, а также данные по сильному ЯЭО для спаренных оснований комплементарных нитей.

Расчет структуры для двойной спирали ДНК относительно прост, так как вследствие спаривания оснований и регулярности структур уже имеются достаточно надежно подтверждаемые структурные гипотезы, среди которых необходимо провести выбор наиболее вероятной и затем уточнить структуру. Подобное справедливо также и для ДНК с одной спиралью или для РНК, еслиони обладают такой структурой, как, например, тРНК.

Если структура фрагмента ДНК известна и проведено отнесение резонансных линий, то можно изучить взаимодействие ДНК со специфическими протеинами. Примером этого может служить взаимодействие с протеином, который является лакрепрессором и подавляет транскрипцию лактозоспецифических ферментов, так что лактоза практически отсутствует в клетках. Структура головной части этого протеина, которая ответственна за связывание с ДНК, недавно была установлена методом ЯМР и опубликована в. По спектрам комплекса, полученным по методу NOESY, можно определить положение протеина относительно ДНК в том случае, если известно лишь несколько расстояний из измерений ЯЭО. Экспериментально по данным ЯЭО для ¹Н для трех различных ароматических колец лак-репрессора найдены структуры, соответствующие определенным нуклеотидам лак-оператора. По этим оценочным значениям расстояний получена структура комплекса, в котором лак-репрессор развернут на 180° в сравнении со структурой, полученнной из модельных представлений.

3. Состав и структура полисахаридов

Третью группу биологических макромолекул, состоящих из простых фрагментов, образуют олиго- и полисахариды. Они состоят из простых моносахаридных фрагментов, связанных между собой. Функции полисахаридов весьма разнообразны. Они играют роль резервных веществ, например крахмал, и структурных элементов, например целлюлоза. Важную функцию распознавания клеток, а также роль рецепторов выполняют поверхностные элементы: олигосахариды и малые полисахариды, связанные с липидами, свойства которых определяет их первичная структура.

Основные фрагменты полисахаридов – моносахариды – обнаруживают большее разнообразие, чем аминокислоты. Правда, моносахариды с пятью атомами углерода и с шестью атомами углерода встречаются чаще, чем другие углеводы.

Моносахаридные фрагменты обычно связаны между собой гликозидными связями. В отличие от протеинов для них в основном характерно наличие разветвленных цепей, так как для сахаридов каждая из гидроксигрупп может образовывать точку ветвления.