Эколого-физиологические особенности микроскопических грибов представителей рода Aspergillus, выделенных из разных местообитаний (стр. 5 из 7)
В качестве источника углерода были выбраны из легкоусвояемых – сахара: сахароза, арабиноза, ксилоза, галактоза, лактоза и мальтоза; многоатомные спирты: глицерин, сорбит, маннит; а также из полисахаридов – крахмал. Все эти источники были взяты из коллекции химических реактивов кафедры. Из трудноразлагаемых источников углерода были использованы: нефть, целлюлоза, гербицид и пестицид. Целлюлозу добавляли в среду в виде мелко нарезанной фильтровальной бумаги. Для определения способности микроскопических грибов рода Aspergillus использовать в качестве единственного источника углерода гербициды в данной работе использовали гербицид «Пиримифос-метил» или О, О-диметил-О – (2-диэтиламино-6-метилпиримидил-4) тиофосфат – это жидкость соломенного цвета, практически не растворим в воде, хорошо растворим во многих органических растворителях, неустойчив в кислой и щелочной средах, является эффективным средством для борьбы со многими насекомыми и клещами. Для определения способности микромицетов рода Aspergillus использовать пестициды в качестве источника углерода применяли дуст. Сахара, крахмал и многоатомные спирты добавлялись в среды в количестве 30 г./л, нефть – 30 мл/л, целлюлоза – 10 г./л, гербицид – 0,25 мл/л и пестицид – 0,001 г./л.
2.2 Принципы составления питательных сред для грибов. Основные принципы композиции сред
При составлении питательных сред для грибов обычно пользуются результатами предварительных исследований по выяснению значения для роста и развития изучаемого объекта концентрации отдельных компонентов (источников углерода, азота, зольных веществ и витаминов).
Основными правилами, которых придерживаются при составлении сред, способствующих росту грибов, являются следующие:
1) целесообразно применять отдельные источники углерода и азота;
2) концентрация вещества, служащего источником азотного питания, должна сильно уступать концентрации вещества – источника углерода (примерно в 10 – 15 раз).
Хотя среды натурального происхождения более благоприятны для роста большинства грибов, однако при физиологических экспериментах по изучению развития и обмена у грибов использовать их нежелательно, так как их состав непостоянен. Для этих экспериментов обычно используются синтетические среды. Одной из первых синтетических сред для грибов (культур видов аспергиллов и пенициллов) была среда Роллена следующего состава (г/л):
сахароза – 72 (около 5%);
винная кислота – 4 (для подкисления среды);
фосфорнокислый аммоний – 4;
углекислый калий – 0,6;
сернокислый аммоний – 0,25;
сернокислый цинк – 0,07;
сернокислое железо – 0,07;
кремнекислый калий – 0,07;
дистиллированная вода – 1500 мл.
Более простой состав имеет среда Чапека (г/л):
сахароза – 30;
NaNO3 – 2;
MgSO4 – 0,5;
FeSO4 – 0,01;
KH2PO4 – 1;
KCl – 0,5;
дистиллированная вода – 1000 мл.
Для многих грибов среды являются неполноценными. Некоторые грибы (особенно витаминозависимые) растут на них плохо или совсем не растут. В таких случаях, если потребность данного организма в витаминах не изучена, необходимо добавлять в среду экстракты растительных или животных тканей, выбирая их исходя из экологии данного гриба. Например, в среды для выращивания грибов – дереворазрушителей добавляют опилки из древесины той породы дерева, которую они поражают в природе, для выращивания грибов – паразитов растений – ткани растения – хозяина; выращивание грибов – копрофилов производится на средах с навозным экстрактом (Беккер, 1983).
2.3 Приготовление питательных сред
Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла. Перед употреблением посуду тщательно мыли, полоскали и высушивали. Среды варили в стеклянных колбах объемом 250 мл. Каждой среды готовили объемом по 100 мл, рассчитанной на 5 культур исследуемых штаммов. После варки среды стерилизовали в автоклаве при 0,5 атм. и 120 ○С в течение 20 минут. После стерилизации и добавления соответствующих источников углеродного питания среды разливали в стерильные чашки Петри по 20 мл. Предварительно в чашки вносят по 1 капле молочной кислоты для подкисления среды, которое необходимо, чтобы убить бактерии.
2.4 Определение способности плесневых грибов использовать соединения углерода
Микромицеты характеризуются неодинаковой способностью использовать различные соединения углерода для конструктивного и энергетического метаболизма. Чтобы выяснить возможность роста гриба за счет тех или иных углеродсодержащих веществ, их высевают на синтетические среды, содержащие в качестве единственного источника углерода различные моно-, ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, углеводороды.
В данной работе определение особенностей роста грибов на различных источниках углеродного питания проводилось путем поверхностного посева исследуемых штаммов на среду Чапека с различными источниками углерода и среду Частухина (для целлюлозоразрушающих грибов). Посев культур осуществляли уколом в центр чашки Петри. Время культивирования составляло 14 суток, температура культивирования – 25±2 ○С. Значение применяемых питательных сред для процессов роста грибов оценивалось методом измерения радиальной скорости роста путем периодического замера диаметра колоний грибов (через каждые 48 часов), растущих на чашках Петри.
Для определения способности микромицетов использовать различные источники углерода применяют и другие методики.
Например, многие микромицеты могут использовать в качестве единственного источника углерода органические кислоты. Для определения способности расти на средах с органическими кислотами рекомендуется плотная среда состава (г/л): (NH4)2HPO4 – 0,5; MgSO4*7H2O – 0,2; NaCl – 0,1; агар – 15,0; органическая кислота в виде соли Na или К – 2,0; pH 6,8. До стерилизации к среде добавляют 20 мл 0,04% водного раствора индикатора метилрот, который в интервале pH 6,8 – 8,4 изменяет окраску от желтой к красной. Среду разливают в пробирки и стерилизуют при 1 атм. Посев проводят уколом. Продолжительность культивирования от 2 до 14 суток в зависимости от скорости роста микроорганизмов. О потреблении органических кислот свидетельствует рост по уколу и изменение кислотности среды в щелочную сторону, что отчетливо заметно по цвету индикатора.
Некоторые грибы способны использовать и такие химически устойчивые соединения, как углеводороды. Выявить способность микроорганизма окислять жидкие нелетучие углеводороды можно на плотной среде состава (г/л): KNO3 – 4,0; KH2PO4 – 0,6; Na2HPO4*12H2O – 1,4; MgSO4*7H2O – 0,8; выщелоченный агар – 2,0; pH 7,2. Среду стерилизуют в колбах при 1 атм. и разливают в чашки Петри толстым слоем. После того как среда застынет, в центре агаровой пластинки вырезают лунку. Для этой цели можно воспользоваться пробочным сверлом (диаметр 8–10 мм), которое предварительно стерилизуют в пламени горелки. Микромицеты высевают радиальными штрихами от лунки к периферии чашки. В лунку вносят 2–3 капли исследуемого углеводорода (стерилизуют фильтрованием). Чашки помещают в термостат строго горизонтально, не переворачивая. Через 7–10 суток отмечают наличие или отсутствие роста по штриху в сравнении с контролем – ростом на среде без углеводорода (Нетрусов, 2005).
2.5 Определение радиальной скорости роста
Определение радиальной скорости роста грибов проводили на плотной питательной среде за определенный промежуток времени. После 48 часов инкубации при 25±20С измеряют диаметр выросших на чашках колоний при помощи линейки. Эту операцию повторяют через каждые двое суток в течение двух недель.
За диаметр отдельной колонии в данный момент времени принимают среднее арифметическое измерение. Вычисление радиальной скорости проводят по формуле:
Kr= (r – ro) / (t – to),
где k – радиальная скорость роста;
ro – радиус колоний в начальной момент времени to;
r – радиус колоний в момент времени t (Паников, 1991).
3. Исследование роста микромицетов рода Aspergillus на различных источниках углеродного питания
Объектами исследования явились различные виды микроскопических грибов рода Aspergillus: A. niger, A. ustus, A. terreus, A.flavus и A. fumigatus. В качестве источника углерода использовали из легкоусвояемых: сахара (сахароза, лактоза, ксилоза, арабиноза, галактоза, мальтоза), многоатомные спирты (глицерин, манит, сорбит), крахмал; из трудноразлагаемых (нефть, целлюлоза, гербицид, пестицид).
В результате посева исследуемых видов Aspergillus на среду Чапека с различными источниками углерода и среду Частухина с целлюлозой было установлено, что изменение экологических условий оказывает существенное влияние на развитие микромицетов. Была изучена способность штаммов использовать различные легкоусвояемые и трудноусвояемые источники углерода методом определения радиальной скорости роста выросших колоний. Оценка возможности потребления различных источников углерода показала, что они способны утилизировать многие источники углеродного питания, но ни один из исследуемых видов не разлагал такие трудноусвояемые вещества, как гербицид и пестицид. Динамика роста видов на разных средах при одинаковых условиях инкубации, не одинакова.
В таблице приложения и на рисунках 1–15 приведены зависимости радиальной скорости роста от времени у изученных грибов на различных источниках углерода.
Рис. 1. Радиальная скорость роста A. niger на сахарах
Уже на первые сутки культивирования A. niger хорошо развивается во всех средах, кроме среды с ксилозой. Затем наблюдается скачок роста на средах с сахарозой и галактозой. К концу времени инкубации скорость роста колоний уменьшается и наибольшей становится на среде с мальтозой. Наибольшие биологические ритмы приходятся на 48–96 ч. и 144–264 ч. времени культивирования.