5. Получение товарной формы.
Производство ферментов при поверхностном культивировании продуцентов
При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и довольно прочно скрепляет твердые частицы субстрата, из которого получают питательные вещества. Поскольку для дыхания клетки используют кислород, то среда должна быть рыхлой, а слой культуры-продуцента небольшим.
Выращивание производственной культуры происходит обычно в асептических условиях, но среду и кюветы необходимо простерилизовать. Перед каждой новой загрузкой также необходима стерилизация оборудования.
Преимущества поверхностной культуры: значительно более высокая конечная концентрация фермента на единицу массу среды (при осахаривании крахмала 5 кг поверхностной культуры заменяют 100 кг культуральной жидкости), поверхностная культура относительно легко высушивается, легко переводится в товарную форму.
Посевной материал может быть трёх видов:
- культура, выросшая на твердой питательной среде;
- споровый материал;
- мицелиальная культура, выращенная глубинным способом.
В три этапа получают и посевную культуру. Сначала музейную культуру продуцента пересевают на 1 - 1.5 г увлажненных стерильных пшеничных отрубей в пробирку и выращивают в термостате до обильного спорообразования. Второй этап - аналогично, но в колбах, третий - в сосудах с 500 г среды.
Основу питательной среды составляют пшеничные отруби, как источник необходимых питательных и ростовых веществ. Кроме того, они создают необходимую структуру среды. Для повышения активности ферментов к отрубям можно добавлять свекловичный жом, соевый шрот, крахмал, растительные отходы. Стерилизуют среду острым паром при помешивании (температура - 105-140 С, время 60-90 минут). После этого среду засевают и раскладывают ровным слоем в стерильных кюветах. Кюветы помещают в растильные камеры. Культивируют в течение 36-48 часов.
Рост делится на три периода, примерно равных по времени. Сначала происходит набухание конидий и их прорастание (температура не ниже 28о С), затем рост мицелия в виде пушка серовато-белого цвета (необходимо выводить выделяемое тепло) и образование конидий. Для создания благоприятных условий роста и развития продуцента необходима аэрация и поддержание оптимальной влажности (55-70%).
Выросшая в неподвижном слое при поверхностном культивировании культура представляет корж из набухших частиц среды, плотно связанных сросшимся мицелием. Массу размельчают до гранул 5-5 мм. Культуру высушивают до 10-12% влажности при температурах не выше 40оС, не долее 30 минут. Иногда препарат применяют прямо в неочищенном виде - в кожевенной и спиртовой промышленности. В пищевой и особенно медицинской промышленности используются ферменты только высокой степени очистки.
Схема очистки сводится к следующему:
- освобождение от нерастворимых веществ;
- освобождение от сопутствующих растворимых веществ;
- фракционирование (как правило, хроматографическими методами).
Для выделения фермента из поверхностной культуры необходима экстракция. Как правило, экстраген - вода. При этом в раствор переходят сахара, продукты гидролиза пектиновых веществ и целлюлозы. Стадию выделения и очистки завершает сушка. После сушки препарат должен содержать не более 6-8% влаги, тогда он может в герметичной упаковке храниться до года без потери активности.
Стандартизация ферментного препарата - доводка активности фермента до стандартной, соответствующей требованиям ГОСТ. Для этого используются различные нейтральные наполнители - крахмал, лактоза и др.
Учитывая огромные перспективы применения ферментных препаратов в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства, медицине, можно сделать заключение о необходимости расширения исследований в этой области для оптимизации технологии и гарантийного получения высокоактивных и стабильных препаратов микробных ферментов.
Иммобилизация ферментов
В современной биотехнологии одно из видных мест принадлежит ферментам. Ферменты и ферментные системы широко используются в различных отраслях промышленности, медицине, сельском хозяйстве, химическом анализе и т.д.
Ферменты - вещества белковой природы и поэтому неустойчивы при хранении, а также чувствительны к тепловым воздействиям. Кроме того, ферменты не могут быть использованы многократно из-за трудностей в отделении их от реагентов и продуктов реакции. Решить эти проблемы помогает создание иммобилизованных ферментов. Начало этому методу было положено в 1916 году, когда Дж. Нельсон и Е. Гриффин адсорбировали на угле инвертазу и показали, что она сохраняет в таком виде каталитическую активность. Сам термин "иммобилизованные ферменты узаконен в 1971 году, и означает любое ограничение свободы передвижения белковых молекул в пространстве.
. Сущность иммобилизации ферментов — прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе или заключение в полупроницаемую мембранную систему. Прикрепление фермента к носителю осуществляется адсорбционно, химической связью или путем механического включения фермента в органический или неорганический гель (в капсулу и т. п.). При этом допускается прикрепление фермента только за счет функциональных групп, не входящих в активный центр фермента и не участвующих в образовании фермент-субстратного комплекса. Носитель фермента или матрица может име^ь вид зернистого материала, волокнистой структуры, пластинчатой поверхности, пленок или тканей, полых волокон, трубочек, капсул и т. д. Имеет значение размер частиц носителя. Важно иметь большую поверхность, поэтому рекомендуются небольшие частицы диаметром 0,1—0,2 мм. Носитель фермента может быть как природное вещество, так и синтетический полимер.
Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными предшественниками:
1. Гетерогенный катализатор легко отделим от реакционной среды, что дает возможность остановить реакцию в любой момент, использовать фермент повторно, а также получать чистый от фермента продукт.
2. Ферментативный процесс с использованием иммобилизованных ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость катализируемой реакции и выход продукта.
3. Модификация фермента целенаправленно изменяет его свойства, такие как специфичность (особенно в отношении макромолекулярного субстрата), зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям.
4. Можно регулировать каталитическую активность иммобилизованных ферментов путем изменения свойств носителя действием физических факторов, таких как свет и звук. Иммобилизовать ферменты можно как путем связывания на нерастворимых носителях, так и путем внутримолекулярной или межмолекулярной сшивки белковых молекул низкомолекулярными бифункциональными соединениями, а также путем присоединения к растворимому полимеру.
Широкое применение в нашей стране и за рубежом находят ферментные препараты и продукты, обладающие амилолитической активностью. В нашей стране выпускают следующие амилолитические ферментные препараты: с активной &-амилазой — Амилоризин П10Х, Амилосубтилин Г10Х; глюкоамилазой — Глюкоамилаза очищенная. Кроме того, производятся белый солод и солодовые экстракты с активной &-амилазой, которые вырабатываются из проросшего зерна ржи или ячменя.
Под действием амилолитических ферментов повышается содержание сбраживаемых сахаров в тесте, что приводит к интенсификации процесса созревания полуфабрикатов, увеличению количества декстринов, что способствует сохранению свежести хлеба.
При добавлении ферментных препаратов в оптимальных дозировках увеличивается объем хлебобулочных изделий, улучшается структура их пористости, мякиш становится более нежным, улучшаются вкус и аромат хлеба, корка приобретает более интенсивную окраску и глянец.
В составе Амилоризина П10Х содержится комплекс ферментов амилолитического и протеолитического действия, наибольшее значение из которых имеет &-амилаза. Продуцентом Амилоризина П10Х является плесневой гриб Aspergillus oryzae. Оптимальные условия действия Амилоризина ШОХ-рН 4,7-5,4 и температура 40-45°С.
Амилосубтилин Г10Х представляет собой очищенный ферментный препарат, образуемый Bacillus subtilis. Препарат содержит &-амилазу, (3-глюканазу и протеазу. Оптимальными условиями действия препарата являются рН 6,0-6,3 и температура 50-55°С. Бактериальная ?-амилаза по сравнению с грибной обладает высокой термостабильностью, температура инактивации составляет 63-71°С.
Амилоризин П10Х и Амилосубтилин Г10Х оказывают наиболее эффективное действие при добавлении к муке с упругой, недостаточно эластичной клейковиной, с пониженной и нормальной сахарообразующей способностью (180—250 мг мальтозы на 10 г муки) и автолитической активностью до 30%.
Глюкоамилаза очищенная (оптимальные условия действия: рН 3,0-5,0; температура 55-60°С) — препарат, продуцентом которого являются гриб Aspergollus awamory или штамм дрожжей Endomycopsiz sp. 20-9, находит применение при производстве высокоосахаренных ферментативных полуфабрикатов и жидких дрожжей.
Значительным недостатком применения амилолитических препаратов является наличие в их составе протеазы, что затрудняет их использование при переработке муки с пониженным содержанием клейковины, а также слабой по силе. Хлебные изделия лучшего качества получаются при совместном внесении амилолитических ферментов и улучшителей окислительного действия.
Отечественный цитолитический ферментный препарат, продуцентом которого является культура гриба Trichothecium rozeum, обладает гемицеллюлазной, целлобиазной, пентозаназной активностью. В результате исследований по поиску возможностей использования в хлебопекарной промышленности Цитороземина П10Х, который отличается высокой цитолитической и незначительной амиполитической и протеолитической активностью, было сделано следующее заключение: добавление его в тесто в диапазоне концентраций от 0,01 до 0,1% к массе муки способствует дополнительному обогащению теста редуцирующими сахарами, приводит к значительному накоплению в нем водорастворимых пентозанов, изменению упруго-пластических свойств клейковины, способствует улучшению реологических свойств геста, что приводит к увеличению объемного выхода хлеба.