Структура и свойства мембранных липидов (стр. 2 из 4)

Многие липиды набухают в воде. Липиды, которые не несут заряда или являются в целом электрически нейтральными, не набухают совсем или набухают лишь в ограниченной степени до предельной толщины водной прослойки между ламеллами. При избытке воды сосуществуют две фазы — мультиламеллярная липидная фаза и вода, находящаяся в основном объеме. Заряженные липиды склонны к неограниченному набуханию и могут включать воду между ламеллами вплоть до пороговой точки, когда образуются две фазы — полностью гидратированные моноламелярные везикулы, находящиеся в равновесии с водой в основном объеме. Степень набухания и относительная стабильность мульти- и моноламеллярных структур определяются электростатическими взаимодействиями. При низкой ионной силе происходит дестабилизация мультиламеллярных структур. Неограниченное набухание может происходить и в том случае, когда в смеси липидов содержится всего несколько процентов заряженных липидов.

Поляризация молекул воды вблизи полярных липидных головок приводит к сильному отталкиванию при сближении двух бислоев. Эта «гидратационная сила» удерживает гидратированные бислои на расстоянии не менее 30 А друг от друга. Именно она создает основной энергетический барьер, который следует преодолеть, пытаясь осуществить слияние мембран. Возможно, фосфатидилэтаноламиновые везикулы склонны к агрегации именно потому, что степень гидратации их полярных головок относительно низка.

Исследования, проведенные методом ЭПР с помощью спиновых меток, способных реагировать на полярность своего окружения на различной глубине от поверхности бислоя, показывают, что вода частично проникает в углеводородную область бислоя, находящуюся в жидкокристаллическом состоянии. По данным нейтронного рассеяния, когда бислой находится в состоянии геля, вода не проникает глубже глицеролового остова липидных молекул.

2.2 ФАЗОВЫЕ ДИАГРАММЫ ОДНОКОМПОНЕНТНЫХ ВОДНО-ЛИПИДНЫХ СИСТЕМ

На рис. 2.5 представлена фазовая диаграмма в координатах температура—концентрация для двух распространенных гликолипидов, выделенных из растений. Дигалактозилдиацилгли-церол образует стабильную ламеллярную фазу. При низком содержании воды имеется только гидратированная фаза, а при содержании воды 20% сосуществуют две фазы — мультиламеллярная гидратированная липидная фаза и вода основного объема. К неограниченному набуханию ДГДГ не способен.

На приведена фазовая диаграмма для дипальмитоилфос-фатидилхолина. Этот липид существует в ламеллярной форме при самых разных условиях. При добавлении воды он «набухает» до тех пор, пока между слоями не скопится максимально возможное количество воды. В этой точке образуется двухфазная система, представляющая собой взвесь мультиламеллярных липо-сом. Обратите внимание, что между фазой геля и жидкокристаллической ламеллярной фазой имеется еще одна фаза. Это так называемая «рифленая» фаза. В этой фазе поверхность бислоя на электронных микрофотографиях имеет волнообразный вид. Температурный фазовый переход Р₀, -» L_a называется главным, а переход ц, -» Р^, — предпереходом.

Липиды, имеющие объемные полярные головки, обычно претерпевают предпереход, свидетельствующий о наличии фазы, промужеточной между гелевой и жидкокристаллической. В Р_а,-фазе дипальмитоилфосфатидилхо-лина ацильные цепи, вероятно, наклонены, хотя спектры комбинационного рассеяния говорят о том, что они по-прежнему, как и в фазе геля, находятся преимущественно в полностью-трянс-конфигурации.

2.3 ДВА МЕТОДА ИЗУЧЕНИЯ ЛИПИДНОГО ПОЛИМОРФИЗМА

Кроме метода дифракции рентгеновских лучей для характеристики свойств липидных фаз использовали и другие методы. Один из них, оказавшийся особенно полезным, — это электронная микроскопия замороженных сколов. Второй метод, ³¹Р-ЯМР, был введен в исследовательскую практику несколько позже и нашел применение для обнаружения небислойных структур, которые, как полагают, играют особую роль в биологических мембранах.

1. Электронная микроскопия липидных фаз с применением метода замораживания—травления. Этот метод оказался очень полезным при изучении структурной организации различных липидных фаз. Примеры получаемых при этом электронных микрофотографий приведены на рис. 2.7. Жидкокристаллическая фаза на этих микрофотографиях всегда выглядит как гладкая поверхность, а Р^.-фаза — как рифленая. Геле-вая фаза выглядит как гладкая поверхность, но при определенных условиях приготовления препарата имеет спиральную текстуру из-за возникновения случайных дефектов в плотной упаковке. Гексагональная фаза, образуемая такими лип идами, как ненасыщенный фосфатидилхолин, выяляется на микрофотографиях после замораживания—травления как стопка цилиндров. При приготовлении образцов липиды уравновешивают в условиях, подходящих для формирования нужных структур, а затем быстро замораживают, чтобы организация этих структур не успела измениться.

Электронно-микроскопические методы использовались также для изучения «липидных частиц». Эти частицы нередко наблюдаются в бинарных смесях, если один из липидов склонен образовывать фазу Ни, а другой — бислойные структуры. Липидные частицы образуются в чисто липидных образцах и потому отличаются от «белковых частиц», которые наблюдаются в биологических мембранах и в реконструированных белково-липид-ных системах. Было высказано предположение, что липидные частицы представляют собой вывернутые мицеллы, расположенные внутри бислоя, и что они играют определенную роль в биологических процессах, облегчая слияние мембран или стабилизируя их на сильно искривленных участках, как, например, в мем^ бране тилакоидов. Однако четких доказательств биологической роли липидных частиц пока не получено.

2. Исследование бислоев методом ^пР-ЯМР. Этот метод также используется для структурной характеристики гидратирован-ных липидов. Например, фосфолипиды в гексагональной фазе Ни дают спектры ³¹Р-ЯМР, резко отличающиеся от спектров фосфолипидов в ламеллярной фазе. С помощью этого метода исследовался переход ламеллярной фазы в гексагональную в липидах и липидных смесях. Недостатком метода является некоторая неопределенность при интерпретации спектров в случае изотропного усреднения за счет относительно быстрых движений. Полагают, что такой спектр отвечает структурам типа «липидных частиц», однако это объяснение не является единственно возможным. Как было показано, метод ³¹Р-ЯМР позволяет надежно установить наличие гексагональной Ни-фазы в чисто липидных дисперсиях, но в случае биологических мембран к подобным выводам следует относиться с осторожностью, особенно если они не подтверждены другими методами.

Метод ³¹Р-ЯМР оказался весьма полезным при определении ориентации и динамического поведения полярных головок фосфолипидов, а также структурных возмущений, вносимых в бислой мембранными белками.

2.4. ОРИЕНТАЦИЯ ПОЛЯРНЫХ ГОЛОВОК ЛИПИДОВ В БИСЛОЕ

Данные ряда методов свидетельствуют о том, что в ламелляр-ных водно-фосфолипидных дисперсиях, как и в липидных кристаллах, полярные головки липидов в целом ориентированы параллельно плоскости бислоя. В случае фосфатидилхолинов такая ориентация присуща как гелевой, так и жидкокристаллической фазам, судя по результатам исследований методами дифракции нейтронов и рентгеновских лучей. Об этом же свидетельствуют и данные, полученные методом ²Н-ЯМР, хотя при этом не исключаются и другие интерпретации. Имеющиеся данные указывают на то, что пространственное расположение полярных головок фосфа-тидилглицерина, сфингомиелина и фосфатидилсерина сходно. Исследования методом ²Н-ЯМР интактных фибробластов мыши и выделенных из них мембран также показали, что полярные головки как фосфатидилхолина, так и фосфатидилэтаноламина ориентированы параллельно поверхности мембран. Однако по данным дифракции нейтронов у фосфатидилглицерола, выделенного из Е. coli, полярная головка ориентирована примерно под углом 30° к поверхности мембраны, что облегчает связывание отрицательно заряженных фосфатных групп с катионами.

На ориентацию и динамику полярных головок липидных молекул может влиять образование межмолекулярных водородных связей на поверхности мембраны. Донорами и акцепторами при Образовании этих связей могут служить такие липиды, как фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин и различные гликолипиды. Исследования, проведенные на модельных мембранных системах, показывают, что водородные связи между полярными головками сохраняются даже в условиях гидратации мембранной поверхности, однако пока неизвестно, как образование этих связей может сказаться на структуре биологических мембран.