Состояние глутатионового звена антиоксидантной системы крови практически здоровых людей с лор-паталогиями, проживающих в различных районах города Красноярска (стр. 6 из 9)
Реактивы:
1. Сложный буфер: 0,1М Трис-HCl-буфер, pH8,5, содержащий 6мМ ЭДТА и 12мМ азид натрия. Непосредственно на этом буфере готовят 4,8 мМ раствор GSH
2. 0,14%-ный раствор трет-бутил гидропероксида
3. 20%-ный раствор ТХУ
4. 0,1 М трис-HCl буфер, pH8,5
5. ДТНБК на абсолютном метаноле, 0,01М
Активность рассчитывают по формуле:
,где:
А - активность фермента, мкмоль/мин×л;
∆С – разность концентраций GSH в опытной и контрольной пробах;
Vпр. – объем пробы, используемый для определения концентрации GPO
t – время инкубации;
Vр.с..- объем реакционной смеси;
201 – степень разведения эритроцитов в гемолизате;
1000 – коэффициент для пересчета активности GPO от молярной к миллимолярной;
Hb – гемоглобин г/л;
Активность GPO можно также выразить в мкмоль\мин на 1 г Hb
2.6. Определение активности глутатион-S-трансферазы
Принцип метода: активность глутатион-S-трансферазы определяли по скорости образования глутатион-S-конъюгатов между GSH и 1-хлор-2,4-динитробензолом (ХДНБ).
Увеличение концентрации конъюгатов в ходе реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 340 нм (максимум поглощения глутатион -S- ХДНБ) [Habig etal., 1974].
Ход определения
Источником фермента служил осмотический гемолизат, который готовили добавлением к одному объему упакованных эритроцитов двадцати объемов дист. Н2О, охлажденной до 0°С. В кювету с длиной оптического пути 1,0 см, содержащую 2,5 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера рН=6,5, добавляли 0,2 мл 0,015 М раствора восстановленного глутатиона и 0,1 мл гемолизата. Реакцию инициировали внесением в кювету 0,2 мл 0,015М ХДНБ (готовили на абсолютном метаноле). Параллельно опытной готовили контрольную пробу, в которую вместо гемолизата вносили дист. Н2О. Регистрацию оптической плотности проводили при t=25°C и длине волны 340 нм против воды сразу после перемешивания в течение трех минут. Активность фермента рассчитывали, используя коэффициент экстинкции для ГS-ХДНБ при длине волны 340 нм, равный 9,6 мМ-1*см-1, и выражали в ммолях образующихся глутатион S-конъюгатов в минуту на грамм Hb.
Реактивы:
1. 0.1М калий – фосфатный буфер РН6,5;
2. 0.015М раствор GSН;
3. 0.015М раствор ХДНБ.
Активность GPO рассчитывают по следующей формуле:
где:
А – активность фермента, моль\мин×Hb
∆E – изменение оптической плотности в мин.
d – толщена кюветы (1см)
f – коэффициент разведения эритроцитов в пробе
ε – коэффициент молярной экстинкции при χ=340нм (9600М-1×см-1)
Hb – гемоглобин г/л
1000 – коэффициент для пересчета активности GST от молярной к миллимолярной;
Vпр. – объем пробы, используемый для определения активности GST
Vр.с..- объем реакционной смеси;
2.7. Определение активности глутатионпероксидазы
Принцип метода: определение активности глутатионредуктазы основано на измерении скорости окисления NADPH, которая регистрируется спектрофотометрически по уменьшению оптической плотности при длине волны 340 нм .
Для определения активности глутатионредуктазы использовали осмотический гемолизат, приготовленный следующим образом. К одному объему упакованных и отмытых от плазмы эритроцитов добавляли девяти кратный объем холодной дистиллированной воды.
Ход определения:
В спектрофотометрическую кювету с расстоянием между рабочими гранями 10 мм последовательно вносят 2,7 мл калий-фосфатного буфера, 0,1 мл раствора NADPH, 0,1 мл гемолизата и 0,1 мл раствора GSSG. Реакция запускается добавлением в пробу окисленного глутатиона. Смесь перемешивают. Изменеие оптической плотности регистрируют через 1 минуту в течение 3 минут против пробы, содержащей все компоненты, кроме GSSG.
Реактивы:
1. 50 мМ калий-фосфатный буфер , рН 7,0, содержащий 1мМ EDTA;
2. 0,1 мМ раствор NADPH;
3, 0,5 мМ раствор окисленного глутатиона (хранят в замороженном виде).
Активность фермента выражают в мкмолях ¤г Hb в минуту. Расчет производят по формуле:
,где:
А – активность глутатионредуктазы;
DЕ – изменение оптической плотности;
К – коэффициент, учитывающий разведение эритроцитов в реакционной пробе, равный 300;
6,22 – коэффициент экстинкции для NADPH в см-1/мМ-1, при длине волны 340 нм;
t – время наблюдения, мин;
d – расстояние между рабочими гранями кюветы (10 мм);
Hb – гемоглобин в г/л.
2.8. Статистическая обработка результатов
В работе использованы стандартные статистические приемы подсчета, медианы, определения 25 и 75 перцентеля с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0. Достоверность полученных данных оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, с достоверностью Р<0,05, корреляционный анализ по Спирману.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Анализ содержания GSH и активности глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крови практически здоровых людей и людей с ЛОР-заболеваниями
Воздушные загрязнения играют ключевую роль в развитии окислительного стресса, который является причинной развития патологии дыхательной системы [Менщикова, 2008]. Особое положение, которое занимает эпителий легкого в отношении организма с насыщенной кислородом внешней средой, делает его объектом токсичного действия радикалов экзогенного и эндогенного происхождения. Острые респираторные заболевания являются главной причиной детской смертности: от пневмонии ежегодно в мире умирает более 4 млн. детей. В последние десятилетия наблюдается рост числа хронических неспецифических заболеваний легких, в настоящее время они занимают 3-е место среди причин смертности, в северных регионах на них приходится на 2/3 всех дней нетрудоспособности [Менщикова, 2008].
Проведенные исследования показали, что содержание восстановленного глутатиона у ЛОР-больных людей в 1,29 раза ниже, чем у практически здоровых людей. Активность GPO и GST в эритроцитах у ЛОР-больных людей снижается в 2,77 и 1,46 раз соответственно, по сравнению с активностью исследуемых показателей в эритроцитах практически здоровых людей. По активности GR достоверных отличий между исследуемыми группами не обнаружено. Полученные данные приведены в табл. 2.
Изменения содержания GSH и активности глутатионзависимых ферментов может быть обусловлено увеличением образования АФК при ЛОР-патологиях, поскольку процесс развития острых респираторных заболеваний сопровождается генерацией большого количества АФК [Miller, 1995]. Ингаляция атмосферных прооксидантных поллютантов приводит к увеличению количества альвеолярных макрофагов [Martin, 1985]. При контакте с мембраной альвеолярного макрофага частицы воздуха интенсивно повышают уровень потребления клеткой кислорода. Практически весь дополнительно поглощенный кислород не используется ни на энергетические, ни на пластические потребности клетки. Особая ферментная система фагоцитов, встроенная во внешнюю клеточную мембрану – NADPH-оксидаза изменяет электронную структуру молекулы кислорода, превращая его в главное оружие бактерицидной защиты клетки – кислородные радикалы. Прооксиданты повышают проницаемость эпителия, повреждают фибробласты, снижают выработку суперксидного аниона полимофноядерными нейтрофилами. Повреждающее действие АФК заключается в увеличении эпителиальными клетками слизи с высоким молекулярным весом, ослаблении функции ресничек, стимуляции образования тромбоксана, снижении сурфактантной активности [Lee, 1997].
Таблица 2
Содержание GSH и активность глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крови практически здоровых и ЛОР-больных людей
| Показатели | Здоровая группа Median | ЛОР-группаMedian | Достоверностьотличий |
| GSHМкмоль/гHb | 2,581,60 4,87N=91 | 2,001,49 2,16N=29 | Р<0,05 |
| GPOМкмоль/мин*гHb | 28,1617,9444,50N=89 | 10,178,3630,50N=20 | Р<0,05 |
| GSTМоль/мин*гHb | 12,14 10,0314,14N=90 | 8,335,1911,40N=28 | Р<0,05 |
| GRМоль/мин*гHb | 10,597,0013,06N=67 | 11,33 10,00 13,64N=6 | нет |
Найденное нами снижение активности ферментов глутатионового метаболизма также может быть связано с непосредственным модифицирующим действием АФК, на ферментативные белки. Так DeviesK.J. и сотрудники (1987) показали в опытах invitro, что НО· или НО· + О`2 вызывают изменение первичной, вторичной и третичной структур белковой молекулы. На примере большого количества белков авторы выявили высокую их чувствительность к действию АФК, что сопровождается в зависимости от типа АФК либо фрагментацией, либо агрегацией белковых молекул. Так, для большинства белков интенсивное воздействие радикалов НО· приводит к их агрегации, но в присутствии О`2 предпочтительным процессом становится фрагментация белковых макромолекул. Следствием таких структурных повреждений является, в частности, резкое повышение чуствительности белков к протеолитической деградации [Devies, 1995; Дубинина, 2001; Пасечник, 2001]. Окисление отдельных аминокислот (серосодержащих, ароматических и других) ферментов сопровождается изменением ферментативной активности и структуры белка [Devies, 1995]. При этом окисленные белки способны выступать в качестве источника свободных радикалов и истощать запасы клеточных антиоксидантов, таких как аскорбиновая кислота и глутатион [Simpson, 2002; Dean, 2007; Cakatay, 2000]. In vitro показано, что продукты CРО белков опосредуют окислительное повреждение ДНК [Halliwell, 2001; Morin, 1998]. Таким образом, окисленные протеины являются не только «свидетелями», но и активными участниками процесса свободнорадикального повреждения.