1. Рекомбинантные (химерные) ДНК
Создаваемые генными инженерами рекомбинантные ДНК называют химерными. Они были созданы для самых разнообразных целей, в том числе и для целенаправленого воздействия на ВИЧ. В последние годы число научных работ в этом направлении очень велико. Одна из испытанных схем с использованием химерных ДНК заключалась в следующем. К гену, кодирующему белок-рецептор CD4 , "подшили" другой ген, который обеспечивает синтез растительного белка рицина. Рицин еще в средние века использовался в качестве сильнейшего яда. Попадая в клетку, он блокирует синтез белка в цитоплазме, тем самым убивая ее. После внесения в клетки такой рекомбинантной ДНК в конечном итоге происходит образование кодируемого ей химерного белка. Та его часть, которая соответствует белку-рецептору, обеспечивает строго специфическое связывание химеры с клетками, на поверхности которых содержится вирусный белок CD4. Другая же представляет собой яд рицин и уничтожает клетки, с которыми связывается химерная молекула. Таким образом, одна часть химеры обеспечивает направленный поиск в организме клеток, зараженных вирусом, а другая ее часть убивает их. Схема довольно проста и эффективна. В качестве "убийцы" можно использовать не только ген рицина, но и некоторые другие гены.
Другой подход к борьбе с ВИЧ-инфекцией основан на способности некоторых вирусных белков ( Tat и Rev ), чрезвычайно важных для размножения ВИЧ в клетках, специфически связываться с определенными участками молекулы вирусной РНК. Для того, чтобы предотвратить этот жизненно важный процесс, было предложено вводить в инфицированные клетки искусственно синтезированные РНК, содержащие участки связывания с вирусными белками. Вирусному белку все равно, с чем связываться - с вирусной РНК или точно такой же "копией", сконструированной искусствено. Добавленная в клетку в большом количестве, "копия" играет в данном случае роль "ловушки": если ее много, белок вируса будет связываться преимущественно с ней, а не с РНК вируса, и, в результате этого, ВИЧ перестанет размножаться.
Теоретически описанные подходы выглядят очень привлекательно. И, как показали проведенные испытания, в изолированных клетках они работают очень хорошо. Однако нет надежных способов доставки и обеспечения долгого функционирования химерных "конструктов" в целом организме.
Указанные трудности ученые пытаются преодолеть с помощью тех же вирусов. Недавно опубликовано сообщение об успешном использовании для противодействия ВИЧ вируса бешенства. Естественно, это был не вирус сам по себе, а его вариант, который не способен приводить к заболеванию. К такому варианту был "пришит" ген белка CD4. В остальном схема была та же, что и в случае с рицином. Связываясь только с ВИЧ-инфицированными клетками, рекомбинантный вирус их уничтожал, другие же клетки оставались неизменными. Возможно, такой путь окажется эффективным в будущем.
Недавно появилось сообщение о создание еще одной "химеры" против ВИЧ на основе антиретровирусного препарата энфервиртид.
Энфервиртид представляет собой короткий фрагмент белка gp41 ВИЧ , который, несмотря на то, что он вроде как "родной", препятствует вирусу "сливаться" с клеткой. На основе ретровируса мышей сконструировали химерный вирус, который способен в клетках человека производить такой короткий фрагмент белка ВИЧ и "выставлять" его на поверхности клеток, зараженных химерным вирусом. В результате ВИЧ не может проникать в клетки даже при наличии в них всех рецепторов и корецепторов. Таким образом, фрагмент вирусного белка выступает в качестве "щита" против целого вируса. Очень важно, что защита срабатывает на самом начальном этапе инфицирования клетки. Ведь когда вирус уже проник в нее, с ним бороться практически невозможно. Начатые в клинике испытания новой "химеры", по утверждению исследователей, дали очень обнадеживающие результаты.
2. Конструирование рекомбинантных ДНК
Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. Ключевыми в этом определении являются слова "фрагмент ДНК" и "объединение in vitro", что указывает на сущность генетической инженерии и ее отличие от всех остальных методов получения гибридных (или химерных) организмов, таких как генетическая селекция, эмбриональная инженерия и т.д.
Фрагменты ДНК, в том числе и фрагменты, содержащие гены, получают с использованием ферментов рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты как с тупыми, так и с липкими концами. Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК.
Сшивка по одноименным "липким" концам (рестриктазно лигазный метод)
Этот метод является самым распространенным и популярным. Впервые этим способом гибридная ДНК была получена С. Коэном с сотрудниками в 1973 году. Некоторые рестриктазы, например Pst I, внося в цепи ДНК симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы на равных расстояниях от центра сайта узнавания и образующие "ступеньку" (рис. 36). Эти комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований, и поэтому их называют комплементарными или липкими концами. Спаривание оснований происходит только между комплементарными последовательностями, поэтому ААТТ-концы, образуемые Eco RI, не будут спариваться, например, с АГЦТ-концами, образуемыми Hind III. Но любые два фрагмента (независимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов (рис. 39).
Однако после такого спаривания полной целостности двойной спирали не восстановится, поскольку останется два разрыва в фосфодиэфирном остове. Для его восстановления, то есть сшивания, или лигирования нитей используют фермент ДНК-лигазу. Этот фермент в живой клетке выполняет ту же функцию - сшивание фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации.
Сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод)
Липкие концы не абсолютно необходимы для связывания фрагментов ДНК. Тупые концы также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам. Впервые такие эксперименты были выполнены в 1972 году Полем Бергом в Стенфордском университете, США. Липкие концы также можно ферментативным путем присоединить к молекулам ДНК с тупыми концами. Для этого используют фермент - концевую трансферазу из тимуса теленка, которая присоединяет нуклеотиды к 3 -концам цепей ДНК. Если к 3'-концам одного из рекомбинируемых in vitro фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достроить одноцепочечные олиго (dA)-сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента — олиго (dT)-сегменты примерно такой же длины, то при смешении полученных таким образом фрагментов происходит спаривание за счет образования водородных связей между олиго (dА)- и олигo (dT) -последовательностями (рис. 40). Для ковалентного соединения двух фрагментов используется ДНК-лигаза. Эти процедуры составляют основу для второго общего метода получения рекомбинантных молекул ДНК.
Поскольку можно формировать достаточно длинные взаимокомплементарные одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью. В частности, поэтому при клонировании ДНК-копий матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах, обычно ис¬пользуют коннекторный метод. При таком способе соединения между фрагментами встраиваются участки ААААА. Такие дополнительные последовательности ТТТТТ могут влиять на функции соединяемых молекул и поэтому всегда, когда только возможно, для получения рекомбинантных молекул ДНК пользуются липкими концами, образовавшимися в результате действия рестриктаз.
Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами
В ситуации, когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, то есть некомплементарные друг другу липкие концы, применяют так называемые линкеры (или "переходники"). Линкеры - это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Впервые эту идею предложил Шеллер с сотрудниками в 1977 году.
Существуют большие наборы таких генных "переходников". Естественно, что при использовании линкеров должна учитываться необходимость соблюдения правил экспрессии генетической информации. Часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, промотор или участок, связанный с рибосомой. В этом случае линкеры обеспечивают не только объединение генов, но и обуславливают их экспрессию. Существуют линкеры "тупой конец - липкий конец".
При необходимости липкие концы можно превратить в тупые. Это достигается либо отщеплением липких концов с помощью фермента - эндонуклеазы S1, которая разрушает только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы "застраивают", то есть с помощью ДНК-полимеразы I на однонитевых липких концах синтезируют вторую нить.
3. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК
Описанные методы, позволившие идентифицировать генетически важные участки ДНК, имели большое значение сами по себе. Но они также проложили путь к разработке исключительно эффективных методов секвенирования ДНК и создания рекомбинантных молекул. Секвенирование позволяет довольно быстро определить полную нуклеотидную последовательность сегмента длиной 100 - 500 нуклеотидных пар, образующегося при расщеплении ДНК рестрикционными эндонуклеазами.