Картирование хромосом с помощью гибридизации. РНК-зонды или денатурированные ДНК-зонды могут гибридизоваться с соответствующими последовательностями денатурированной ДНК, входящими в состав хромосом с характерными морфологическими признаками. Положение радиоактивно меченного зонда определяют, нанеся на препарат, подготовленный для микроскопического исследования, чувствительную эмульсию; в том месте эмульсии, которое контактирует с гибридным участком, появляются темные зерна серебра. Проведя микроскопическое исследование всего препарата, можно локализовать зонд. Довольно точные данные удается получить в случае больших политенных хромосом Drosophila в основном благодаря тому, что положение темных областей можно соотнести с характером исчерченности хромосом.
Однако определение положения единичных генов в небольших и весьма многочисленных хромосомах растений и позвоночных путем гибридизации insitu затруднено по двум причинам. Во-первых, не всегда легко идентифицировать отдельные хромосомы.
Это зависит от их размера, положения центромеры и характерного рисунка из темных и светлых полос, образующегося после окрашивания фиксированных метафазных хромосом определенными красителями. Кроме того, сами полосы захватывают слишком большие отрезки ДНК. Например, 3"109 пар нулеотидов гаплоидного генома человека содержатся менее чем в 1000 различных полосах, а у растений это число даже меньше. В результате с помощью чувствительной эмульсии можно установить лишь, в какой области хромосомы находится интересующий нас сегмент. Более того, размер зерен серебра и его разброс уменьшают разрешающую способность примерно до 107 пар оснований.
Вторая проблема-чувствительность зондов. Масса одной копии фрагмента дуплексной ДНК длиной 1 т.п. н. составляет примерно 10-12 мкг. Радиоактивно меченные зонды, полученные с помощью ник-трансляции, редко имеют удельную радиоактивность, значительно превышающую 108 расп. /мин на 1 мкг. Гибридизация такого зонда с одним сопоставимым сегментом в хромосоме дает только 10-4 расп. /мин на 1 мкг, или примерно один распад в неделю. Чтобы достичь необходимой чувствительности, следует одновременно использовать несколько специальных приемов. Например, чтобы получить зонды с удельной радиоактивностью примерно 109 расп. /мин на 1 мкг, можно провести ник-трансляцию с использованием в качестве субстрата 1251-5-йодСТР. Гибридизацию следует проводить в присутствии декстрансульфата, что увеличивает скорость процесса примерно в 100 раз, в результате чего усиливается сигнал. Число зерен также может возрасти, если одноцепочечные последовательности векторной ДНК, которые сцеплены с гибридизуемой эукариотической последовательностью в клонированном зонде, будут в свою очередь гибридизоваться с избытком молекул зонда. Для увеличения числа зерен серебра можно увеличить время экспозиции до нескольких недель. Таким способом удается определить положение единичных копий генов в специфических, но весьма обширных областях хромосом млекопитающих.
Картирование хромосом, основанное на получении гибридных соматических клеток. Для локализации клонированного сегмента в определенной хромосоме используют межвидовые соматические гибриды. Обычно такие гибридные соматические клетки содержат полный набор хромосом одного вида и только одну или небольшое число хромосом второго вида. Чтобы судить о наличии данного гена в определенной донорной хромосоме, анализируют группу разных линий гибридных клеток и устанавливают корреляцию между присутствием тестируемого гена и наличием специфической хромосомы.
Гибридные соматические клетки образуются при 1) слиянии клеток двух разных видов;
2) слиянии клеток одного вида с мини-клетками другого, содержащими одну или несколько донорных хромосом;
3) трансфекции реципиентных клеток препаратом очищенных хромосом донора. Чтобы элиминировать неслившиеся донорные и реципиентные клетки, применяют соответствующие селективные условия. Например, донорные клетки могут проявлять чувствительность к определенным лекарственным веществам, а реципиентные клетки могут быть мутантами, растущими лишь в особых условиях. В присутствии таких препаратов и в среде HAT растут только гибридные клетки, несущие в донорной хромосоме функциональный ген тимидинкиназы.
Если отобранные гибридные клетки выращивать в неселективных условиях, то донорные хромосомы в конце концов утратятся в силу более или менее случайных причин. Но клоны гибридных клеток можно получить в любой момент и идентифицировать резидентные донорные хромосомы по характеру исчерченности, выявлению ранее картированных последовательностей ДНК или ферментативных маркеров либо с использованием всех трех методов. Таким способом можно получить банки различных линий гибридных клеток, каждая из которых содержит определенный набор донорных хромосом.
Альтернативный подход состоит в сохранении селективных условий. Поддерживая условия, благоприятные для данного гена, в течение многих клеточных генераций, можно получить линии клеток только с одной стабильной донорной хромосомой. Другой способ получения гибридных клеток с одной донорной хромосомой состоит в трансфекции препаратом, обогащенным этой хромосомой.
При конструировании гибридов возникает вопрос, какой из видов будет служить донором, а какой - реципиентом. Ответ на него обычно можно найти лишь экспериментальным путем. Как правило, гибридные клетки "человек-мышь" утрачивают хромосомы человека.
После идентификации чужеродных хромосом в соматических клетках гибридов используют три подхода, для того чтобы установить, присутствует ли тестируемый ген в определенной хромосоме. Первый основан на выявлении корреляции между наличием этой хромосомы и экспрессией тестируемого гена с образованием определенного продукта. Для этого измеряют ферментативную активность или выявляют взаимодействие со специфическими антителами; при этом необходимо, чтобы используемые методы позволяли различать продукты генов донорных и реципиентных клеток. Например, два белка-продукта генов могут иметь разную электрофоретическую подвижность, как, например, в случае галактокиназ грызунов и приматов. При втором подходе используют гибридизацию между клонированным зондом и набором хромосом гибрида insitu; этот подход имеет уже описанные ограничения. Третий и наиболее общий подход связан с идентификацией искомого гена путем отжига соответствующего ДНК - или РНК-зонда с ДНК, выделенной из гибридных клеток и перенесенной на нитроцеллюлозный фильтр. Отжиг с эндонуклеазными фрагментами часто позволяет выявить донорный ген во фрагментах, имеющих размеры, типичные для донорного генома, даже в тех случаях, если гены донора и реципиента являются перекрестно гибридизующимися. Поскольку трудно получить гибриды с одной донорной хромосомой, обычно исследуют целый набор гибридных клеток, которые содержат разные донорные хромосомы. Если этот набор достаточно обширен, то присутствие последовательности зонда обычно можно связать с присутствием определенной хромосомы.
Используют также гибридные соматические клетки, содержащие лишь часть определенной хромосомы донора. Например, некоторые линии донорных клеток содержат хромосому с делецией или хромосому, несущую небольшой транслоцированный участок из другой хромосомы, и за прошедшие годы были выделены и охарактеризованы многие линии гибридных клеток, содержащие делетированные или составные донорные хромосомы. Например, с помощью таких гибридных клеток гены тяжелой цепи иммуноглобулина человека были локализованы в положении 32 длинного плеча хромосомы 14. Были проанализированы две линии гибридных клеток мыши и человека, каждая из которых содержала одну из пары реципрокных транслокаций между хромосомой 14 и Х-хромосомой. Зонд, представляющий собой клонированный ген иммуноглобулина, гибридизовался только с ДНК из гибрида, содержащего часть хромосомы 14, соответствующую q32.
В результате анализа клонов из библиотек, содержащих ДНК одной хромосомы, были получены детальные карты участков индивидуальных хромосом. Наиболее прямой путь получения таких библиотек состоит в использовании отдельных очищенных хромосом. Другой подход основан на использовании ДНК из гибридных соматических клеток, содержащих только одну донорную хромосому. Из такой библиотеки могут быть отобраны рекомбинанты, содержащие последовательности донорной ДНК, по их способности гибридизоваться с видоспецифичными зондами.
в. Нестабильность при клонировании
Как правило, клонированные вставки представляют собой точные реплики геномных последовательностей, однако иногда во время клонирования в этих последовательностях происходят изменения. Несоответствие размеров клонированной вставки и сегмента геномной ДНК чаще всего бывает обусловлено рекомбинациями, делециями или вставками, произошедшими во время клонирования. Нередко наблюдаются вариации в размерах вставки или в ее рестрикционной карте при повторном выделении. Если клонированный фрагмент содержит тандемные повторы, то при расщеплении рекомбинантной ДНК часто получается сложная смесь рестрикционных фрагментов. Например, некоторые фрагменты могут быть представлены в количестве меньшем, чем моль-эквивалент. Это тоже свидетельствует о происшедших во время репликации рекомбинантной молекулы перестройках, что приводит к образованию смешанной популяции рекомбинантов. Перестройка состоит в гомологичной рекомбинации, сопровождающейся делециями и амплификациями клонированных тандемно повторяющихся единиц. Подобная нестабильность клонированных повторов в Е. сой-системах хозяин-вектор уменьшается, но не устраняется полностью в клетках, мутантных по функциям рекомбинации.
Ген овальбумина присутствует в гаплоидном геноме курицы в единственном экземпляре, однако многие гены и некоторые другие сегменты ДНК встречаются в геноме множество раз. Типичными примерами геномов с многократно повторяющимися последовательностями ДНК являются эукариотические геномы. Иногда несколько копий в таком геноме бывают абсолютно идентичны, и тогда при отжиге смеси рестрикционных фрагментов геномной ДНК с меченым гомологичным зондом на электрофореграмме наблюдается одна полоса, четко видимая даже в том случае, когда количество расщепляемой ДНК не превышает 1 мкг. Обычно для обнаружения сегмента, представленного в геноме млекопитающих лишь однократно, требуется не менее 10 мкг ДНК, поэтому появление полосы при количестве ДНК 1 мкг и менее свидетельствует о том, что данный сегмент представлен в геноме многократно. Если разные копии последовательности различаются по одной или нескольким парам оснований, то у них могут быть и неодинаковые сайты для рестриктирующих эндонуклеаз. В результате на радиоавтограмме будет присутствовать множество полос или она будет представлять собой одно размытое темное пятно; это зависит от числа копий повторяющейся последовательности.