ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время используются несколько подходов в получении трансгенных животных. Наиболее широко распространен метод микроинъекций чужеродной ДНК (чДНК) в пронуклеусы зигот. Оптимальные условия для проведения микроинъекций в пронуклеусы зигот мышей описаны в работе Бринстера и соавторов (1994).
Величина вводимой ДНК может достигать 30 Mb. Интеграция нескольких копий (от 1 до нескольких сотен) экзогенной ДНК в геном происходит, как правило, в одном сайте в ориентации "голова к хвосту" или "голова к голове". При инъекции нескольких рекомбинантных конструкций, их встраивание в геном, также происходит в одном сайте.
Другой подход в получении трансгенных животных заключается в инфицировании ранних эмбрионов млекопитающих рекомбинант-нымиретровирусами. Недостатком этого метода является получение трансгенных животных с мультисайтовой интеграцией трансгена и его нестабильной наследуемостью в поколениях.
Еще одним подходом в получении трансгенных животных является использование трансформированных чужеродной ДНК, эмбриональных стволовых клеток, путем инъекции последних в полость бластоцисты. Основным преимуществом данного метода является возможность проводить направленный мутагенез на уровне целого организма, при помощи гомологичной рекомбинации чужеродной ДНК с геномной ДНК.
Для получения трансгенных животных использовались и другие методы, к которым относятся: применение сперматозоидов, обработанных экзогенной ДНК, для оплодотворения яйцеклеток в условиях invitro; использование липосом в качестве вектора чужеродной ДНК. Однако, эти методы имеют значительно менее широкое распространение, в сравнении с методом микроинъекции чужеродной ДНК в пронуклеус зиготы.
1. МЕТОДЫ ТРАНСГЕНЕЗА В ЖИВОТНОВОДСТВЕ
Трансгенные животные - это индивидуумы, в геном которых искусственно введена дополнительная генетическая информация (трансген). Такая информация представляет собой либо отдельный участок ДНК с собственными (гомологичными) регуляторными последовательностями (эукариотическая транскрипционная единица), либо сконструированный из различных молекул ДНК гибридный (рекомбинантный) ген. Таким образом, трансген - это искусственно введенный и интегрировавшейся в ДНК животных чужеродный ген. Под трансгенезом понимают процесс переноса и интеграции чужеродной генетической информации в геном животных.
1.1 Метод микроинъекции
Впервые о получении трансгенных сельскохозяйственных животных сообщили две лаборатории в США и Германии [Hammer et al, 1985; Brem et al., 1985]. В обоих случаях для переноса генных конструкций в эмбриональные линии был использован метод микроинъекции. Этот метод и сегодня остается наиболее широко используемым для трансгенеза в животноводстве.
Суть метода микроинъекции заключается во введении раствора генных конструкций в мужской пронуклеус зигот. Обычно инъецируют 1-2 пкл раствора ДНК в концентрации, соответствующей 1000 копиям в 1 пкл микроинъекционного раствора. При этом исходят из того, что количество 1000 копий/пкл приблизительно соответствует концентрации X нг/мкл, где X - длина генной конструкции в тысячах парах нуклеотидов (т.п.н). Например, если длина генной конструкции равна 10 т.п.н., то количество 1000 копий в 1 пкл будет достигаться при концентрации равной 10 нг/мкл.
Для более точного расчета концентрации генных конструкций используют следующую формулу:
Число копий (копий плк) = 6,023 *1023*С*10-9 /Mr, где 6,023*1023 - число копий в 1 М растворе;
С - концентрация ДНК [мкг/мл];
Mr - молекулярная масса [мг/моль].
Для расчета концентрации измеряют оптическую плотность раствора генной конструкции на спектрофотометре при длине волны 260 нм. 1 OD соответствует концентрации двуточечной ДНК равной 50 мкг/мл. При расчете молекулярной массы исходят из того, что молекулярная масса 1 п.н. равна 6,6 * 108 мг/моль.
Об успешном выполнении микроинъекции судят по увеличению объема пронуклеуса в 1,5-2 раза [Брем и др., 1995]. В эмбрионах мышей кроликов, овец и коз пронуклеусы достаточно хорошо визуализируются под микроскопом при увеличении х400 без выполнения каких-либо дополнительных манипуляций. Что касается эмбрионов свиней и крупного рогатого скота, то вследствие наличия в цитоплазме темных липидосодержащих гранул определение местоположения пронуклеусов в них затруднено. Для смещения этих гранул к краям эмбриона и облегчения тем самым локализации пронуклеусов выполняют центрифугирование эмбрионов свиней и КРС при 15000 об/мин в течение 3 мин. [Wall et ai, 1985]. По завершении микроинъекции эмбрионы культивируют несколько часов до момента их пересадки в яйцевод синхронизированных реципиентов. Эмбрионы КРС культивируют in vitro в течение 6-7 дней до достижения ими стадий морулы или бластоцисты и затем выполняют пересадку в матку синхронизированных реципиентов. После рождения от всех животных отбирают пробы ткани для анализа на интеграцию трансгена. Степень интеграции, то есть число трансгенных животных от общего числа родившихся животных, при использовании метода микроинъекции в зависимости от вида животных колеблется в незначительных пределах. Так, у мышей этот показатель в среднем составляет 15%, у свиней - 10-15%, у кроликов - 10%, у овец, коз и КРС -5-10% [Брем и др., 1995]. Наиболее важным, с точки зрения затрат, требующихся для получения одного трансгенного животного, является показатель общей эффективности трансгенеза, который рассчитывается как отношение числа полученных трансгенных животных к общему числу пересаженных эмбрионов, выраженное в процентах. Величина этого показателя также относительно постоянна и составляет у мышей -2%, у кроликов 1%, у овец и коз – 0,5 – 1%, у свиней и КРС – 0,5%. На частоту интеграции оказывает влияние степень очистки инъекционного раствора, форма и концентрация ДНК, состав буферного раствора, качество эмбрионов, способ пересадки эмбрионов реципиентам (нехирургический, хирургический, лапароскопический). При использовании раствора MSOF(синтетическая среда эмбрионов) для микроинъекции зигот крупного рогатого скота (Hageman [1995]) было показано, что инъекция раствора MSOF не оказывала влияния на жизнеспособность эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vitro. Так, доли эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты, в группах MSOF и контрольной составляли, соответственно, 27,6% и 27,5%. В группе ТЕ до стадии бластоцисты развились лишь 13,9% инъецированных зигот. Сопоставляя результаты двух приведенных выше исследований, можно предположить, что буфер MSOF окажется более эффективным по сравнению со стандартным раствором ТЕ для получения трансгенного крупного рогатого cкота и других видов сельскохозяйственных животных.
Не смотря на достигнутые в области трансгенеза успехи, эффективность получения трансгенных сельскохозяйственных животных остается очень низкой [Wall et al., 1992; Wall et al. 1997] что побуждает исследователей искать новые подходы. Одним из путей повышения эффективности трансгенеза является разработка методов оценки эмбрионов на трансгенность перед ихпересадкой реципиентам. К ним относится использование в конструкциях репортерных генов, таких как β-галактозидаза, щелочная фосфотаза и др., а также определение трансгенов в эмбрионах методом ПЦР и флюоресцентной гибридизации.
Не смотря на использование большого числа маркеров, не было разработано системы, позволяющей повысить эффективность трансгенеза у сельскохозяйственных животных. Основные подходы, исполбзующиеся в настоящее время:
1.2 Использование ретровирусных векторов
Результативным способом переноса ДНК в эмбриональные линии животных является применение ретровирусных векторов.
Ретровирусы – семейство эукариотических вирусов, генетический материал которых представлен одноцепочечной РНК.
Вирусы состоят покрытых липопротеидной оболчкой вирусных частиц диаметром 70-120 нм и внутренней капсулы икосаэдрической формы, которая содержит две копии геномной РНК длиной 5-10 тысяч пар нуклеотидов в форме рибонуклеопротеида. Внешняя оболочка вируса является частью цитоплазматической мембраны клетки хозяина и представлена короткими гликопротеидами. Эндогенные ретровирусы являются хромосомными элементами и составляют до 1% ДНК в геноме человека [Tarusio Mantovani, 1998]. Эндогенные ретровирусы являются одной из разновидностей ретроэлементов, составляющих до 10% генома млекопитающих.
По своей способности инфицировать клетки хозяина ретровирусы подразделяются на экотропные и амфотропные. Экотропные вирусы способны реплицироваться в клетках только одного или нескольких близко родственных видов животных. Так, например, вирус лейкемии мыши (MLV) размножается только в клетках мыши и крысы. Амфотропные вирусы, наоборот, имеют широкий спектр хозяев и способны к размножению в клетках различных видов млекопитающих.
Геном всех способных к репликации ретровирусов устроен аналогичным образом и состоит из трех кодирующих регионов, которые, не смотря на то, что речь идет о последовательностях РНК, получили название генов. Ген gag кодирует белки капсида и вирусного кора. Ген pol кодирует вирусную реверсивную транскриптазу и другие связанные с вирусом нуклеазы. Ген env кодирует гликопротеиды в вирусной липидной оболочке.
Геномные РНК ретровирусов содержат на свох концах повторяющиеся последовательности, которые в зависимости от типа вируса имеют длину от 10 до 80 нуклеотидов. Они получили название R-сегментов. На 3' конце геномной РНК R-сегмента расположен регион U3 длиной 170-1250 нуклеотидов, а на 5' конце r-сегмента регион u5 длиной 80-100 нуклеотидов.При образовании ДНК-копии вирусного РНК-генома на концах молекулы происходят изменения: на 5' конце располагается сегмент U3, а на 5' – U5.Такие характерные для ДНК-формы ретровирусоа участки получили название LTR – длинных концевых повторов. LTR, расположенный на 5' конце несет очень сильный промотер, тогда как LTR на 3' конце содержит сигналы полиаденилирования РНК.