Получение мембранного белка бактериородопсина, меченного дейтерием по остаткам ароматических аминокислот L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана (стр. 2 из 3)
Получение метиловых эфиров дансиламинокислот гидролизатов бактериородопсина. К 20 мл 40 %-ного КОН в 40 мл эфира добавляли 3 г влажной нитрозометилмочевины и перемешивали на водяной бане со льдом в течении 15-20 мин. После интенсивного газовыделения эфирный слой отделяли и промывали ледяной водой до рН 7,0, сушили безводным NaSO4 и обрабатывали им препараты дансилпроизводных аминокислот в составе гидролизатов бактериородопсина.
Бензилоксикарбонильные производные аминокислот получали реакцией Шоттен-Баумана по методике, указанной в работе [16].
Тонкослойную хроматографию (ТСХ) производных аминокислот проводили на пластинках “Silufol UV-254” (Чехо-Словакия) в системах: (A)-хлороформ-метанол-уксусная кислота (10:1:0,3) для бензилоксикарбонильных производных аминокислот и (Б)-хлороформ-метанол-ацетон (7:1:1) для метиловых эфиров дансиламинокислот. Аналитическое и препаративное разделение карбобензоксипроизводных аминокислот и метиловых эфиров дансиламинокислот в составе гидролизатов бактериородопсина проводили методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе “Knauer” (ФРГ), снабженным насосом “Knauer”, УФ-детектором “2563” и интегратором “С-R 3A” (Shimadzy, Япония). Использовали колонки: гиперсил ODS, 5 мкм, 3 250 мм, силасорб С18, 12 мкм, 10 250 мм. Элюирование проводили в системе растворителей по двум вариантам: (А)- вода-трифторуксусная кислота (100/0,1-0,5 об/об) и (В)- ацетонитрил-трифторуксусная кислота (100/0,1-0,5 об/об) при различных градиентных режимах, как описано в работе [17]. Бензилоксикарбонильные производные аминокислот детектировали по поглощению при 254 нм. Метиловые эфиры дансил-аминокислот детектировали по флуоресценции в УФ-свете.
Масс-спектры электронного удара производных аминокислот получены на приборе “MB-80 A” (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Получение дейтерий-меченного бактериородопсина. Выбор способа получения бактериородопсина был определен целью исследования, связанной с изучением принципиальной возможности получения дейтерий-меченных препаратов бактериородопсина в препаративных количествах. При выборе L-[2,3,4,5,6-2H5]-фенилаланина, L-[3,5-2H2]-тирозина и L-[2,4,5,6,7-2H5] -триптофана в качестве источников изотопных меток, авторы учитывали важность этих аминокислот в функционировании бактериородопсина, стабильность дейтерий-меченных аналогов указанных аминокислот к (1H-2H) обмену в водной среде в условиях культивирования, а также возможность их детектирования методами масс-спектрометрии. Кривые, отражающие динамику роста штамма H. halobium ЕТ 1001 на пептоновой среде (1), обычной синтетической среде(2) и синтетической среде (3), содержащей дейтерий-меченные аналоги аминокислот L-Phe, L-Tyr и L-Trp представлены на рис. 1. Как видно из рис.1, рост H. halobium ЕТ 1001 на пептоновой среде происходит лучше чем на синтетической, однако для получения дейтерий-меченного бактериородопсина пептоновая среда не подходит ввиду наличия в ней немеченных аминокислот. Поэтому пептоновая среда была заменена на синтетическую среду, в которую добавляли дейтерий-меченные аналоги ароматических аминокислот.
Способ получения дейтерий-меченного бактериородопсина представлен на схеме. Основными этапами при получении дейтерированных препаратов бактериородопсина было: культивирование штамма H.halobium ЕТ 1001 на средах, содержащих дейтерий-меченные аналоги ароматических аминокислот, разрушение клеток и получение суспензии пурпурных мембран, очистка суспензии пурпурных мембран от обломков клеток и клеточной ДНК, очистка от каротиноидов, солюбилизация белка в додецилсульфате натрия (ДСН) и осаждение конечного продукта метанолом (см. схему). При получении пурпурных мембран, клетки обрабатывали дезоксирибонуклеазой, для того чтобы разрушить клеточную ДНК. Вследствие того, что препараты пурпурных мембран содержат примеси каротиноидов и обломки клеточных стенок, было необходимо применять специальные методы очистки и выделения белка. При выделении фракции белков из бактериальных объектов необходимо учитывать наличие в них небелковых примесей. В случае богатых белками штаммов сравнительно небольшим количеством примесных соединений в них часто пренебрегают, используя в качестве белковой фракции остаток после исчерпывающего отделения пигментов и липидов экстракцией органическими растворителями. В специальных случаях для получения фракции индивидуальных белков следует прибегать к их осаждению и очистке [18]. Выделение мембранного белка заключается в его солюбилизации в растворе детергента и последующим осаждении белка. Для этого пурпурные мембраны суспендировали в растворе ДСН. Выбор ДСН в качестве детергента в данном случае оправдан, так как бактериородопсин является интегральным белком. Выделение бактериородопсина после отделения осколков клеточных стенок из раствора ДСН достигали, осаждая белок метанолом. Наиболее трудоемкой была стадия очистки бактериородопсина от каротиноидов, которая приводила к значительным потерям хромопротеида. Для этого был использован метод низкотемпературной экстракции каротиноидов ацетоном.
Культивирование H. halobium ЕТ 1001на синтетической среде, содержащей L-[2,3,4,5,6-2H5] -фенилаланин, L-[3,5-2H2]-тирозин и L-[2,4,5,6,7-2H5]-триптофан. 
Культуральная жидкость 
Отделение биомассы 
Сырая биомасса 
Промывка клеток дист. Н2О 
Дезинтеграция клеток ультразвуком
Ацетон. Экстракция пигментов и липидов Экстракт пигментов и 
Хлороформ, липидовметанол.
Фракция суммарных белков 
Обработка дезоксирибонуклеазой 
Фракция пурпурных мембран. 
Ацетон Очистка от каротиноидов Экстракт каротиноидов 
Раствор ДСН Осаждение белка Остатки клеточных стенокМетанол
Бактериородопсин 
Гидролиз белка 
Раствор 6 н. HCL с 3%-ным фенолом Раствор 4 н. Ba(OH)21. Дансилхлорид,
диазометан Модификация аминокислот2. Карбобензоксихлорид
Разделение производных аминокислот обращенно-фазовой ВЭЖХ 
Индивидуальные производные аминокислот 
Масс-спектрометрический анализ производных аминокислотСхема получения дейтерий-меченного бактериородопсина из H. halobium и определения степени включения дейтерия в аминокислоты белка.
В качестве примера на рис.2,а-в изображены спектры поглощения пурпурных мембран на различных стадиях очистки от каротиноидов. Как видно из рис. 2,в, спектр поглощения бактериородопсина после экстракции от каротиноидов имеет трехполосный вид: полосы на длинах волн 568 нм и 410 нм определяются наличием хромопротеида, полоса поглощения при длине волны 280 нм определяется содержанием ароматических аминокислот в полипептидной цепи этого белка. (Для чистого бактериородопсина соотношение D280/D568 равно 2:1). Согласно предложенной схеме можно получить десятки миллиграмм дейтерий-меченного бактериородопсина, переработав 200-300 мг бактериальной биомассы. Обращенно-фазовая высокоэффективная хроматография ВЭЖХ метиловых эфиров дансилпроизводных аминокислот и бензилоксикарбонильных производных аминокислот, полученных из гидролизатов бактериородопсина показала высокие степени хроматографической чистоты выделенных аминокислот и отсутствие примесей не белковой природы в гидролизатах бактериородопсина (см. ниже).