Учет реакции ведут через 5 — 10 мин после водяной бани, и окончательный результат получают через 10— 12 ч. Степень задержки гемолиза оценивают в крестах: (++++) — 100%-ная задержка гемолиза; (+++) — 75%-ная; (++) — 50%-ная; (+) — 25%-ная задержка гемолиза; (-) — полный гемолиз.
При производственной необходимости после определения типовой принадлежности вируса ящура устанавливают его подтип (вариант). Для этого ставят РСК по той же методике, но используют вариантные сыворотки и вариантные антигены установленного типа. Причем вариантные сыворотки используют в предельном титре, а антигены в удвоенном. Антиген (исследуемый) относят к тому варианту, с сывороткой которого он дает положительную реакцию в более высоких разв Едениях .
Заключение. Испытуемый штамм относится к варианту A22.
Когда доставленного из хозяйства вирусного материа недостаточно для исследования в РСК, проводят его расплодку на культуре клеток или на 3-6-дневных мышатах-сосунах, или на взрослых морских свинках. Мышатам исследуемую суспензию вводят подкожно в области спины в дозе 0,1—0,2 мл, морским свинкам — внутрикожно в подушечки обеих задних конечностей в дозе 0,2—0,5 мл. За животными наблюдают 5—7 дней.
В случае гибели мышат из их тушек готовят антиген для РСК. У морских свинок в положительных случаях на лапках образуются афты; стенки афт и их содержимое используют в РСК. При необходимости проводят 2—3 "слепых" пассажа. Пробу исследуемого материала считают отрицательной, если в третьем пассаже не будет отмечено дегенерации клеток и падежа белых мышей, а при исследовании полученных из них суспензий в РСК не будет обнаружен антиген вируса ящура.
Ретроспективная диагностика.
Сыворотку, полученную общепринятым методом, консервируют антибиотиками (по 500 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина) или замораживают при минус 20 °С. На исследование направляют от каждого животного не менее 5 мл сыворотки в термосе со льдом.
В лаборатории сыворотку исследуют с помощью реакции радиальной иммунодиффузии (РРИД) и реакции непрямой иммунофлуоресценции (НРИФ).
РРИД. Сущность реакции заключается в формировании зоны специфической преципитации вирусных антигенов антителами, включенными в состав агарового геля. РРИД типоспецифична.
Для постановки реакции расплавленный 2%-ный агар смешивают с равным объемом нагретой до 50—55 °С испытуемой сыворотки в разведениях 1 : 5, 1 : 10, 1 : 20 и т. д. до 1 : 320 и наносят по 4 мл на предметное стекло. В застывшем агаре вырезают лунки (диаметром 4—7,7 мм), которые заполняют эталонными типовыми антигенами. Затем стекла помещают во влажную камеру при температуре 37 °С. Результаты учитывают через 6—7 ч и окончательно через 18 ч.
Положительная реакция характеризуется образованием кольца преципитации в виде опалесцирующей зоны вокруг лунки с антигеном, гомологичным возбудителю, вызвавшему заболевание .
Антитела, обнаруженные в испытуемой пробе сыворотки, относят к тому серотипу, с антигеном которого они дали положительную реакцию. Их титром считают максимальное разведение испытуемой сыворотки, с которым наблюдается положительная реакция.
После переболевания животных титры антител обычно превышают 1 : 160.
Техника постановки заключается в следующем. На препарат из культуры клеток ВНК-21, ПЭК, ПЭС, инфицированных вирусом ящура любого типа, наносят испытуемую сыворотку в разведении 1: 10 и 1 :20; инкубируют во влажной камере при 37 °С 30 мин; отмывают несвязавшиеся антитела; подсушивают на воздухе и окрашивают смесью рабочих разведений флуоресцирующей антивидовой сыворотки и бычьего альбумина, меченного родамином; Инкубируют во влажной камере при 37 °С 30 мин; отмывают; подсушивают и просматривают под люминесцентным микроскопом (объектив х40, окуляр х4 или х5). Положительная реакция характеризуется зеленым или из рудно-зеленым свечением цитоплазмы клеток.
Диагностический результат считают положительным при обнаружении специфического свечения хотя бы в одной из 5—10 сывороток, присланных из данного хозяйства.
Для определения уровня обнаруженных таким образом антител в испытуемой сыворотке проводят ее титрование. Для этого испытуемую сыворотку разводят от 1 : 40 до 1 : 1280, и каждым разведением обрабатывают заведомо инфицированный препарат, как было указано выше. О титре постинфекционных антител в сыворотке судят по предельному ее разведению, которое способно давать положительную НРИФ. Наличие специфического свечения в препаратах, обработанных испытуемой сывороткой в разведениях 1 : 10, 1 : 20 и 1 : 40, свидетельствует о том, что сыворотка была получена в период острого переболевания животного ящуром, т. е. с момента его заболевания прошло около 7 дней, а наличие специфического свечения в разведениях 1 : 80 и выше — о том, что сыворотка взята от животного-реконвалесцента.
Результаты исследования на ящур оформляют в виде протокола, в котором указывают дату исследования, наименование хозяйства, материала, краткие эпизоотологические данные и т. д. и обязательно наименование компонентов, используемых в исследовании, характеристику контролей.
Необходимо отметить, что для индикации и типирования вируса ящура разработано много других методов, таких, как ПЦР, РНГА, ИФА, метод перекрестного иммунитета и др.; для обнаружения и типирования антител — РН, РНГА, реакция серозащиты на мышатах-сосунах и др.
Дифференциальная диагностика. Необходимо исключить другие заболевания животных с везикулярным синдромом, такие, как ВД, ИРТ, везикулярный стоматит, у свиней — везикулярную болезнь, везикулярную экзантему, у овец — катаральную лихорадку.
Иммунитет и специфическая профилактика.
Продолжительность иммунитета у животных, переболевших ящуром, составляет 8—12 мес, у свиней — 10—12, у овец — 18 мес. При очень напряженном иммунитете может наблюдаться некоторая устойчивость к заражению гетерологичным типом вируса. При ящуре возникает тканевой и гуморальный иммунитеты. Основное значение в защите животных от заболевания принадлежит гуморальным факторам иммунитета. Для специфической профилактики ящура применяют инактивированные вакцины. В нашей стране нашли широкое применение следующие 3 вакцины: лапинизированная гидро-окисьалюминиевая сапонинформолвакцина, которую готовят из вируса, репродуцированного в организме новорожденных крольчат; гидроокисьалюминиевая сапонинформолвакцина из вируса,культивируемого в ткани слизистой оболочки языка.
Для свиней используют противоящурную эмульгированную вакцину из лапинизированного вируса.
Иммунитет после вакцинации у взрослых животных длится 4— 6 мес. После ревакцинации иммунитет более напряженный и продолжительный.
Молодняк, родившийся от иммунных животных, получает пассивно антитела с молозивом. Антитела у телят сохраняются в течение 5 мес, хотя пассивная защита продолжается до 3—4 мес.
Инактивированные вакцины могут быть моно- или поливалентными, т. е. содержать антигены одного или многих типов и вариантов вируса. Живые вакцины против ящура не разработаны. Проводятся исследования по разработке и использованию синтетических вакцин, а также молекулярных вакцин, полученных с помощью методов генной инженерии.
4. Культивирование вирусов в культуре клеток
Культуры клеток и тканей – это кусочки органов и тканей, выращенных в питательной среде вне организма, сохраняют жизнеспособность, а некоторые размножаются.
Для культивирования необходимы:
- исходный материал (ткани эмбрионов, клетки почки, кожи, селезенки). Обязательо соблюдение правил асептики и антисептики;
- температура должна быть 36 -38 градусов Цельсия;
- питательная среда , которая должна обладать буферностью и изотоничностью, т.е. включать в себя Na, K, Ca, Mg, Cl, фосфаты, карбонаты;
- РН среды должна быть 7,2 – 7,4 единиц;
- все питательные элементы, особенно глюкоза, которая отвечает за энергетический обмен;
- аминокислоты;
- витамины, которые являются ко-ферментами.
Среды бывают двух видов:
1. натуральные или естественные ( кровь, амниотическая жидкость);
2. 2.синтетические и полусинтетические (из химических веществ, солевые растворы – раствор Эрла и раствор Хэнкса)
Методика сводится к следующему:
1. подбору культуры клеток;
2. получению вирус -содержащего материала;
3. подготовке для заражения;
4. заражению клеток вируссодержащим материалом;
5. культивированию вируса в клетках;
6. индикации вируса в культуре клеток;
7. сбору культуральной жидкости и идентификации в ней вируса.
Подбор культур клеток. Не всякая клетка чувствительна к любому вирусу. Вирус к первичной культуре обычно успешно адаптируется при условии, если культура получена из органов животного, естественно восприимчивого к данному вирусу. Однако адаптация вируса к перевиваемым клеткам более сложна, а в ряде случаев неосуществима. Для культивирования некоторых вирусов до сих пор неизвестно ни одной клеточной системы. Для культивирования вируса используют обычно молодые клетки, т. е. в первый день формирования монослоя, а в некоторых случаях (для парвовирусов свиней) клетки заражают при их посеве, так как вирус интенсивно размножается при наличии делящихся клеток (когда они находятся в стадии логарифмического роста).