В этом случае на наш взгляд адекватным термином был бы «протеолитическая модификация», поскольку термин «ограниченный протеолиз» указывает лишь на то, что свершен акт гидролиза ограниченного числа пептидных связей, и не говорит о том, что этот акт сопровождается образованием новой формы белка (пептида), наделенного специфическими функциями.
Таким образом, если с участием пептидгидролазы осуществлен гидролиз пептидной связи в белковой молекуле и при этом образовался белок с новыми свойствами и функцией, обеспечивающего нормальное функционирование клетки, можно ли в таком случае, говоря о двух путях деградации белка – лизосомальном и нелизосомальном, приравнивать эти пути по функциональному назначению? Можно говорить о взаимосвязи этих путей, поскольку некоторые белки, пептиды, образовавшиеся в реакциях с участием ферментов нелизосомальной локализации, могут быть гидролизованы в лизосомах и наоборот.
Из вышесказанного становится очевидным, что протеолитическая система нелизосомальной локализации в отличие от лизосомальной, где осуществляется генерализованный распад белка, имеет отношение к образованию активных форм молекул пептидной природы, необходимых для функционирования клетки, организма, то есть эти две системы различаются по своему функциональному назначению.
В нервной ткани обнаружены ферменты, участвующие в модификации некоторых нейроспецифических белков, в обмене нейропептидов . Эти и подобные по функциональному назначению пептидгидролазы нелизосомальной локализации представляют исключительный интерес для понимания нейрохимических механизмов функционирования нервной системы. В изучении пептидгидролаз нелизосомальной локализации нервной ткани в последнее время достигнуты значительные успехи. Обзор работ по этим ферментам, который будет представлен ниже, является свидетельством большого интереса к пептидгидролазам нервной ткани нелизосомальной локализации, и вместе с тем это лишь первые шаги в выяснении функциональной роли этой группы пептидгидролаз.
Пептидгидролазы нелизосомальной локализации по сравнению с таковыми лизосом изучены в меньшей степени. Причиной этому было множество факторов, среди которых можно выделить длительное время бытовавшее представление о роли внутриклеточных пептидгидролаз, как аппарате деградации белка и более высокую активность ферментов лизосом по сравнению с другими . Лизосомальные пептидгидролазы были первыми в ряду изучаемых тканевых протеиназ . Этому способствовали и факторы методического характера (доступность субстратов, разработка методов тестирования), и достижения в области биохимии и смежных наук. В частности, открытие Де Дювом лизосом в значительной степени стимулировало изучение лизосомальных ферментов, в том числе лизосомальных пептидгидролаз мозга.
Пептидгидролазы нелизосомальной локализации нервной ткани начали изучаться с некоторым опозданием по сравнению с лизосомальными, но на сегодня идет значительное опережение в выяснении физико-химических свойств и роли ферментов нелизосомальной локализации. Среди пептидгидролаз нервной ткани нелизосомальной локализации в относительно лучшей степени изучены и интенсивно исследуются в наши дни кальций-зависимые протеиназы и ферменты обмена регуляторных пептидов. Интерес к этим ферментам вполне понятен, поскольку они принимают участие в обмене если не нейроспецифических белков и пептидов, то таких, содержание которых в нервной ткани значительно выше по сравнению с другими органами и тканями . В связи с этим, надо полагать, что биологическая роль пептидгидролаз нервной ткани отражает специфику обменных процессов, раскрытие которых необходимо для понимания нейрохимических механизмов деятельности нервной системы.
К эндопептидазам относятся пептид-гидролазы, катализирующие гидролиз пептидных связей внутри белковой молекулы. В настоящее время в нервной ткани обнаружено несколько эндопептидаз нелизосомальной локализации. Следует отметить, что в цитоплазме обнаружено только две эндопептидазы, способные катализировать гидролиз высокомолекулярных белков (кальпаин и мультикаталитический протеиназный комплекс), остальные эндопептидазы цитоплазмы и плазматической мембраны (эндопептидазы ., ., ., пролилэндопептидаза) способны расщеплять лишь сравнительно короткие пептиды, длина которых, как правило, не превышает - аминокислотных остатков . В секреторных везикулах содержится достаточно много эндопептидаз, способных расщеплять высокомолекулярные белки, однако практически все они обладают строгой субстратной специфичностью и способны расщеплять только субстраты, содержащие пары остатков основных аминокислот . Ниже приведена характеристика наиболее важных и относительно хорошо изученных эндопептидаз нервной ткани нелизосомальной локализации.
Сигнальные пептидазы удаляют сигнальный пептид от препробелка и играют центральную роль в секреторном пути, а также в доставке белков в межмембранное пространство митохондрий . Каталитический механизм расщепления препробелков и физико-химические свойства ферментов, осуществляющих его, малоизучен . Однако полагают, что существует несколько сигнальных пептидаз, принадлежащих к новому семейству сериновых протеаз, обладающих специфичностью к определенной последовательности гидрофобных аминокислот и проявляющих максимальную активность при нейтральных значениях pH .
К семейству прогормонконвертаз (фуриновых эндопептидаз) в настоящее время относят ряд субтилизиновых эндопептидаз, локализованных в секреторных везикулах различных тканей. Эти ферменты расщепляют различные пропептиды по парам основных аминокислот . Они имеют сходные физико-химические, каталитические и иммунологические свойства, но отличаются по значениям молекулярной массы, связанными с отличиями в строении С-концевого домена . Они проявляют максимальную активность при pH,-,, активируются ионами Ca+, ингибируются ЭДТА .
В тканевом, региональном и клеточном распределении различных ферментов данного семейства обнаружены существенные отличия. Так, фурин широко распространён во всех тканях организма, тогда как PC/ и PC локализованы, в основном, в эндокринных и нейроэндокринных клетках, а PC обнаружена в семенниках . В нейрональных клетках, осуществляющих процессинг ПОМК, экспрессируется PC, но не PC/ .
В субстратной специфичности указанных ферментов также обнаружены некоторые отличия. Так, PC расщепляет хроматогранин A, а PC/ – нет, PC/ расщепляет проинсулин преимущественно при Arg-Apr, а PC – при Lys-Arg .
В настоящее время не вызывает сомнений, что прогормонконвертазы вовлекаются в процессинг предшественников биологически активных пептидов и секретируемых белков . Эти ферменты не являются пептид-специфичными, но отличия в их субстратной специфичности могут способствовать образованию различных продуктов из одних и тех же предшественников в разных тканях .
Ca+-активируемая нейтральная протеиназа (CANP, кальпаин, Ca+-зависимая нейтральная протеиназа, (К.Ф....)) впервые обнаружена в головном мозге крысы Guroff . Фермент выделен и очищен из головного и спинного мозга, а также других тканей различных видов животных.
CANP из различных источников имеет оптимум pH при pH,-, с максимумом при pH,-,, он является метал-зависимой тиоловой протеиназой и требует для проявления активности присутствия восстанавливающих реагентов. Фермент ингибируется хелатирующими агентами; N-этилмалеимидом, ПХМБ, ПХМФС, иодуксусной кислотой; ингибиторами тиоловых протеиназ лейпептином, антипаином и мерсалилом; N,a-тозил-L-лизин хлорметилкетоном; додецилсульфатом натрия; мочевиной; и полифосфатами АТФ, АДФ, ИТФ и специфичным дипептидным ингибитором кбз-Val-Phe . L-тозиламид---фенилэтилхлорметилкетон, пепстатин, апротинин, ФМСФ, бестатин, фосфорамидон, ингибиторы трипсина из сои и лимы не влияют на активность кальпаина.
Кальпаин является Ca+-зависимым металлоферментом. По чувствительности к ионам Ca+ выделяют три формы фермента:
а) CANP I (mCANP) – кальпаин, активируемый микромолярными концентрациями кальция, проявляет половину максимальной активности при концентрации ионов Ca+ около мкМ, максимальную – около мкМ ;
б) CANP II (mCANP) – кальпаин, активируемый милимолярными концентрациями кальция, проявляет половину от максимальной активности при концетрации кальция - мкМ, максимальную – - мМ ;
в) CANP III – проявляет максимальную активность при концентрации Ca+ мкМ, подвергается быстрому автолизу, после чего проявляет максимальную активность в присутствии, мкМ Ca+ .
Пептидное картирование трёх форм кальпаина с различной чувствительностью к ионам Ca+ показало, что все три формы состоят из общих пептидов, достоверных отличий между этими формами не обнаружено. Моноклональные антитела, полученные к CANP II, в одинаковой степени реагируют и с CANP I и III .
CANP также активируется ионами Sr+ и Ba+, ионы Cu+, Pb+ и Zn+ ингибируют его, другие двухвалентные ионы не влияют на активность фермента .
И m- и mCANP могут быть представлены как одиночной полипептидной цепью с молекулярной массой около кДа, так и гетеродимерами, состоящими из одной большой субъединицы с молекулярной массой около кДа и - кДа и малой субъединицы, причём молекулярная масса малой субъединицы в зависимости от источника и способа выделения может колебаться от кДа до кДа . Кроме того, имеются сообщения об обнаружении трёх высокомолекулярных форм CANP с молекулярной массой в области - кДа и низкомолекулярной формы (- кДа) . Все формы имели очень близкие, но не идентичные иммунологические свойства. В присутствии ионов Ca+ все формы CANP подвергаются быстрому автолизу . По-видимому, такая гетерогенность CANP может быть обусловлена не только существованием всех этих форм in vivo но и появлением их в результате автолиза при очистке. Следует также отметить, что для активации CANP II и III необходимы концентрации Ca+, значительно превосходящие физиологические, поэтому в организме эти формы являются, фактически, проферментами.