Микроорганизмы, выделенные из различных природных жиров (стр. 9 из 21)
Рисунок 3 – Калибровочный график зависимости оптической плотности от содержания белка
2.2.14 Метод определения протеолитической активности (ПС) Вильштеттера и Вальдшмидт-Лейтца в модификации
Метод основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.
Активность (ПС) выражают количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5%-ного раствора желатина с рН 7,3-7,5 1г препарата или 1см3 ферментного раствора за 1 час при температуре 40оС.
За единицу протеолитической активности принимают количество фермента, которое образует 1мг аминного азота за 1 час в принятых условиях опыта.
Необходимые реактивы. Фосфатный буферный раствор с рН 7,3-7,5; 5%-ный раствор желатина, приготовленный на основе буферного раствора, перед употреблением раствор желатина нагревают на водяной бане до 40оС; 1%-ный спиртовой раствор тимолфталеина; 0,1н раствор гидроксида натрия; 96%-ный этиловый спирт.
Техника определения. К 10см3 5%-ного раствора желатина с рН 7,3-7,5 приливают 2см3 испытуемого ферментного раствора и сразу же отбирают 1см3 реакционной смеси в коническую колбу на 50-100см3, куда предварительно налито 20см3 96%-ного этилового спирта и 0,2см3 1%-ного раствора тимолфталеина. Пробу тут же титруют 0,1н раствором гидроксида натрия. После появления голубой окраски в растворе прибавляют еще 4 капли щелочи и на этом титрование заканчивают. Титрование проводят из микробюретки с ценой деления 0,02см3.
Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40оС для гидролиза. Через 3 часа 1см3 реакционной смеси отбирают во вторую коническую колбочку на 50-100см3, куда предварительно налито 20см3 96%-ного этилового спирта и 0,2см3 1%-ного раствора тимолфталеина и титруют аналогично контролю.
Расчет протеолитической активности ПС ведут по формуле (2):
ПС =
, (2)где ПС – протеолитичсекая активность, ед/г;
А – количество аминного азота, накопленное за время опыта в реакционной смеси, мг;
t– время протеолиза, ч;
Р – коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1г препарата или 1см3 жидкого ферментного раствора.
Величина А рассчитывается по формуле (3):
А=(а-ак)×1,4×К, (3)
где A – количество аминного азота, мг;
а – количество 0,1н раствора NaOH, пошедшее на титрование 1см3 опытной пробы, см3;
ак – то же, для контрольной пробы;
1,4 – коэффициент пересчета количества 0,1н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;
К – поправка к титру щелочи.
2.2.15 Определение активности липазы (ЛС) (модифицированный метод Ота, Ямада)
За единицу ферментативной активности липазы принимают такое количество фермента, которое освобождает 21мкмоль олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии оливкового масла при рН 7,0 и температуре 37оС в течении 1часа.
Метод основан на определении путем титрования щелочью жирных кислот, образовавшихся под действием липазы при использовании в качестве субстрата оливкового масла.
Необходимые реактивы. Раствор оливкового масла (субстрат); 2%-ный раствор поливинилового спирта; 1н раствор соляной кислоты (HCl); 0,05н раствор гидроксида натрия (NaOH); фосфатно-цитратный буфер с рН 7,0; 1%-ный раствор фенолфталеина; 90%-ный раствор спирта; 1%-ный раствор фермента.
Техника определения. 5см3 эмульсии субстрата и 4см3 буфера с рН 7,0 помещают в колбу Эрленмейера на 100см3, которую закрывают пробкой. Смесь выдерживают на водяной бане при температуре 37оС в течении 10 минут. Затем к смеси добавляют 1см3 раствора фермента и хорошо перемешивают. Полученную смесь выдерживают при температуре 37оС в течении 1 часа, после чего немедленно добавляют 30см3 этанола для прекращения реакции. Раствор титруют 0,05н раствором NaOH в присутствии 1%-ного раствора фенолфталеина до исчезновения окраски.
Контрольную пробу готовя следующим образом. К смеси субстрата и буфера с рН 7,0, выдержанной при температуре 37оС, добавляют 30см3 этанола, затем 1см3 ферментного раствора и смесь немедленно титруют.
Разность между результатами титрований контрольной и опытной проб соответствует количеству 0,05н раствора NaOH, которое пошло на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся из оливкового масла под действием фермента.
Липазную активность фермента ЛС (в ед/г) определяют по формуле (4):
ЛС=
, (4)где ЛС – липолитическая активность, ед/г;
А – разность между результатами титрований опытной и контрольной проб, см3;
Т – титр щелочи;
В – концентрация образца ферментного раствора, г/см3.
2.2.16 Определение концентрации взвешенных веществ
Предварительно готовят фильтры следующим образом: промывают горячей водой (дистиллированной), затем высушивают до постоянного веса в сушильном шкафу при температуре 105оС.
Для определения содержания взвешенных веществ их отделяют, фильтруя сточную воду, объемом 50-100 см3 через бумажный фильтр средней плотности, доведенный до постоянного веса. Оставшийся на стенках стакана осадок смывают небольшой порцией фильтрата и переносят на фильтр. Осадок смывают небольшим количеством (10-15 см3) спиртоэфирной смеси для удаления веществ, сорбированных на поверхности взвешенных веществ. Фильтр с осадком помещают в тот же бюкс, в котором его взвешивали до фильтрования, и высушивают в сушильном шарфу при температуре 105оС в течение 2 часов. Бюкс закрывают крышкой и охлаждают в эксикаторе над прокаленным хлоридом кальция. Затем взвешивают с абсолютной погрешностью не более 0,0002 г.
Высушивание, охлаждение, взвешивание повторяют до достижения постоянной массы.
Содержание взвешенных веществ определяют по формуле (5):
Х = 
, (5)
где Х – содержание взвешенных веществ;
m1 – масса бюкса с высушенным фильтром и осадком, г;
m2 – масса бюкса с высушенным фильтром, г;
V – объем воды, взятой для фильтрования, см3.
2.2.17 Определение содержания органических веществ
Для определения химического потребления кислорода (ХПК) берут 1-5 см3 профильтрованной воды, прибавляют 2,5 см3 0,25н раствора дихромата калия, 0,4 г сульфата ртути (II), 0,2-0,4 см3 сульфата серебра и при перемешивании приливают концентрированную серную кислоту (7,5 см3 на 1 см3 пробы, 15 см3 на 5 см3 пробы). При этом температура раствора поднимается до 100оС. Через 2 минуты раствор охлаждают до комнатной температуры, приливают 100 см3 дистиллированной воды и титруют избыток дихромата калия 0,25н раствором соли Мора в присутствии 10-15 капель N-фенилантраниновой кислоты или 3-4 капель ферроина. Изменение окраски в первом случае от красной до изумрудно-зеленой, во втором – от голубовато-зеленой до красно-голубой.
Параллельно проводят контрольный опыт без сточной воды.
ХПК выражают в миллиграммах кислорода на 1 дм3 воды (мгО/дм3).
Расчет производят по формуле (6):
(V1-V2)×k×0.25×8×1000
ХПК = , (6)V
где ХПК – химическое потребление кислорода, мг О2/дм3;
V1,V2 – объемы 0,25н раствора соли Мора, израсходованные на титрование в контрольном опыте и пробы сточной воды, см3;
k – поправочный коэффициент для приведения концентрации раствора соли Мора к точно 0,25н;
0,25 – концентрация раствора соли Мора;
8 – эквивалент кислорода;
V – объем сточной воды, взятой на определение, см3.
2.2.18 Отбор проб методом асимметрической бахромы
Для сопоставимости результатов исследований различных факторов или технологических параметров необходимо исключить влияние топографии шкуры, полуфабриката или кожи. В этом случае для отбора средней пробы пользуются методом асимметрической бахромы (МАБ), который заключается в следующем. Намечают необходимое число вариантов исследования и задаются числом образцов (полосок), входящих в группу, предназначаемую для каждого варианта (обычно не менее 4). Чем больше число образцов, тем более достоверным будет среднее значение, характеризующее вариант. Размер образца предопределяется набором физико-механических или физических испытаний, которые предполагается провести, а все образцы должны уложиться в прямоугольник, вписанный в чепрачную часть, показанный на рисунке 3
| 5 | 1 |
| 4 | 2 |
| 3 | 3 |
| 2 | 4 |
| 1 | 5 |
| 5 | 1 |
| 4 | 2 |
| 3 | 3 |
| 2 | 4 |
| 1 | 5 |
Рисунок 3 - Схема отбора проб методом асимметрической бахромы
2.2.19 Определение колористических показателей волосяного покрова
Колористические показатели волосяного покрова определяются на приборе «Пульсар». Образцы тщательно расчесываются, накрывают стеклом и фотографируют. Далее работают при установлении кнопки «режим» - 3.
Предварительно прибор прогревают в течение 30 минут, затем нажатием кнопки «сброс» очищают панели вывода.
Первоначально производят калибровку прибора, для этого устанавливают «режим» - 0 (калибровка прибора); «вывод» - 0. Белую пластину помещают на место отражающего образца; черную – на место измеряемого образца, нажимают «пуск », после загорания «Б» извлекают черную пластину. Снова нажимают «пуск», загорается «I» извлекают белую пластину. Устанавливают на индикаторе «режим» - 1; «вывод» - 0 (измерение прозрачных проб) на место прозрачного образца – дистиллированную воду, нажимают пуск.