Микроорганизмы, выделенные из различных природных жиров (стр. 8 из 21)
2.2.4 Изучение морфологии бактерий
Морфологические свойства изучают путем микроскопирования окрашенных мазков, приготовленных из исследуемой колонии. При этом отмечаются формы микробных клеток, характер их расположения, наличие спор, капсул, жгутиков тинкториальная способность (окрашивание по методу Грама), определяют чистоту культуры. Кроме просмотра окрашенных мазков, устанавливают наличие жгутиков путем исследования культур на подвижность в препаратах «висячая» или «раздавленная» капля, а также путем посева культуры на полужидкий мясопептонный агар (подвижные бактерии вызывают помутнение агара, а неподвижные растут по уколу).
Из колоний готовят мазки, затем окрашивают по Грамму, Трухильо, проводят окраску жгутиков по Леффлеру.
Техника окраски по Граму заключается в следующем:
- На обезжиренном стекле делают мазки микроорганизмов. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют под пламенем горелки;
- Мазки окрашивают в течение 1 мин генцианвиолетом;
- Препарат промывают в слабой струе водопроводной воды в течение 2 с.;
- Окрашивают препарат раствором Люголя в течение 1 мин.;
- Промывают препарат слабой струей водопроводной воды;
- Погружают препарат на 30 секунд в 96 %-ный спирт, взбалтывая последний, после чего препарат подсушивают промокательной бумагой;
- Окрашивают мазки раствором фуксина Пфейффера в течение 30 с.;
- Промывают препарат в слабой струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке, подсушивают промокательной бумагой и микроскопируют.
Грамположительные бактерии окрашиваются в синий или фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный.
Окраска по Трухильо заключается в следующем:
- Мазок фиксируют жаром;
- Наносят водный раствор малахитовой зелени (2 %) и в течение 3 мин подогревают на спиртовке до отхождения влаги;
- Промывают водой;
- Опускают на 1 мин в 0,25 % - ный водный раствор основного фуксина;
- Промывают водой;
- Высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.
При таком методе окраски споры окрашиваются в зеленый цвет.
Окраска жгутиков по Леффлеру:
- Мазок заливают на 15-20 минут протравой Леффлера, необходимо следить, чтобы протрава не подсыхала;
- Препарат промывают дистиллированной водой;
- Окрашивают карболовым фуксином Циля в течении 3 минут;
- Высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.
Клетки и жгутики окрашиваются в красный цвет.
2.2.5 Методика изучения культуральных свойств
Культуральные свойства определяют по характеру роста микробной культуры на плотной и жидкой питательных средах. Характер роста на плотной питательной среде изучают с подробным описанием формы, величины, цвета, поверхности, консистенции, краев и структуры колоний, образованных на синтетической питательной среде.
Микроскопическое изучение колоний проводят под микроскопом. Рассматривая колонии в проходящем свете невооруженным взглядом, описывают следующее: форму колоний; диаметр колоний; цвет, который обуславливается пигментом; рельеф колоний; поверхность; ее блеск, прозрачность; характер краев колоний; структуру колоний, ее консистенцию.
Для определения отношения микроорганизмов к кислороду делают посев уколом на мясопептонный агар (МПА). Посев уколом проводят бактериологической иглой путем прокалывания столбика агара в средней части, следя за тем, чтобы игла нигде не подходила к стенкам пробирки. Не доводя на сантиметр до дна пробирки иглу извлекают и обжигают над пламенем спиртовки.
2.2.6 Метод раздавленной капли
Применяется при исследовании морфологии и подвижности микроорганизмов.
Каплю микробной суспензии помещают на поверхность чистого обезжиренного предметного стекла. При работе с культурой, выросшей на твердой среде, на предметное стекло наносят каплю водопроводной воды, затем стерильной пипеткой берут небольшое количество культуры и перемешивают ее в капле. Покрывное стекло помещают ребром на предметное и осторожно помещают его на суспензию, следя за тем, чтобы между стеклами не было пузырьков воздуха. Избыток жидкости удаляют полоской фильтровальной бумаги.
2.2.7 Определение липолитической активности
Липолитические свойства культуры исследуют на среде определённого состава (бульон Штерна). Готовят бульон следующим образом: к 100 см3 МПБ добавляют 1 см3 глицерина и приливают 2см3 свежеприготовленного 10 %-ного водного раствора сульфита натрия, затем по каплям 10 %-й спиртовой раствор основного фуксина (≈ 5 кап.).
Культуры культивируют в термостате при 37 0С. Отмечают изменение цвета среды, рН (лакмусовой бумагой), помутнение, наличие хлопков.
2.2.8 Приготовление бактериальной суспензии
Стерильную жидкую синтетическую среду разливают в стерилизованные конические колбы по 100 см3.
Для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов, делают посев на скошенный агар.
Подготовленные таким образом культуры инкубируют в термостате 24 ч при температуре (37±5)°С, по окончании чего в пробирки с микроорганизмами вводят 5 см3 соответствующей жидкой синтетической среды, осуществляя процесс механического воздействия. Приготовленную таким образом бактериальную суспензию вносят в колбы, содержащие по 100 см3 соответствующей жидкой синтетической среды.
Культивирование микроорганизмов проводят в термостате при температуре 38±5°С, с переменным механическим воздействием, осуществляемом на ShakerType, с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 1 ч в сутки.
2.2.9 Определение общего количества микроорганизмов (КОЕ)
Сущность метода заключается в определении в 1 см3 воды общего содержания мезофильных аэробов и факультативных анаэробов при культивировании на синтетической питательной среде при температуре 40 °С в течении 24 часов. Определение начинают с приготовления разведений. Для этого в несколько пробирок наливают 10 см3 стерильной воды. В первую пробирку стерильной пипеткой добавляют 1 см3 исследуемой воды. Новой стерильной пипеткой вносят пробу в пробирку со стерильной водой, после чего этой же пипеткой набирают 1 см3 из приготовленного разведения и переносят во вторую, из второй в третью и т. д. Из каждой пробы делают посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. По истечении 24 часов при температуре 40 °С подсчитывают число выросших колоний. Если выросло большое количество колоний, то дно чашки делят на секторы и подсчет ведут в каждом отдельном секторе. Результаты подсчета выражают в количестве бактерий на 1 см3 анализируемой воды с учетом посеянного объема.
2.2.10 Определение мутности
Мутность определяют фотометрическим методом при длине волны 540 нм и толщине поглощаемого слоя 30 мм. Определение мутности проводят до процесса высаливания. При этом исходный раствор отфильтровывают от жира. Стандартным раствором является дистиллированная вода.
2.2.11 Определение кислотности
10 см3 исследуемой жидкости вносят в коническую колбу емкостью 100-250 см3 и титруют 0,1 н раствором едкого натра в присутствии индикатора фенолфталеина до слабо-розовой окраски.
Реакция протекает по схеме:
СН3СООН + NаОН = СН3СООNа + Н2О
Содержание органической кислоты (К), г/дм3 определяют по формуле (1):
а × к ×0,006 ×1000
К = = а × к ×0,6 , (1)10
где К – содержание кислоты, г/дм3;
а – количество 0,1 н раствора щелочи, израсходованной на титрование, см3;
к – поправка к титру едкого натра;
0,006 – количество уксусной кислоты, соответствующей 1 см3 0,1 н раствора гидроксида натрия.
2.2.12 Определение активной реакции среды
Активная реакция среды, т.е. степень ее кислотности или щелочности, характеризуется качественно концентрацией водородных ионов. Концентрацию ионов водорода выражают величиной рН.
Величину рН определяют потенциометрическим методом при помощи потенциометра со стеклянными электродами.
Перед началом измерений прибор включают в сеть при помощи тумблера и дают нагреваться в течение 20 минут.
Электроды перед погружением в раствор тщательно промывают дистиллированной водой и просушивают фильтровальной бумагой .
Вначале измерение проводят по шкале от 0 до 14 (грубое определение), а затем переключают прибор на более узкий интервал.
Перед измерением рН сточную воду хорошо перемешивают и измеряют температуру для введения необходимых поправок.
2.2.13 Биуретовый метод определения белка по Ярош
Метод используется в растворах белков с концентрацией от 0,04 до 1,6 мг/см3.
Необходимые реактивы. Биуретовый реактив – в мерную колбу на 1 дм3 наливают 400 см3 0,2н раствора NaOH, добавляют 9г калия-натрия виннокислого, перемешивают до полного растворения, добавляют 3г сульфата меди (порошка) и 5г йодистого калия, объем доводят до метки 0,2н раствором NaOH; раствор мочевины – к 300г мочевины (карбамида) прибавляют кусочек тимола величиной с горошину, приливают 700 см3 дистиллированной воды и смесь нагревают, затем прибавляют 3г активного угля, перемешивают фильтруют в мерную колбу на 1 дм3, объем доводят до метки дистиллированной водой.
Техника определения. В пробирку наливают 2,4см3 раствора мочевины, 0,1см3 раствора белка и 2,5см3 биуретового реактива. Смесь хорошо перемешивают и пробирки помещают в водяную баню при температуре 40оС на 10 минут. Затем их охлаждают до 20оС. Через 30 минут после добавления биуретового реактива раствор колориметрируют на ФЭК при длине волны 540нм. Количество белка находят по калибровочной кривой, составленной по яичному альбумину.
Для построения калибровочной кривой готовят исходные водные растворы с содержанием 10, 20, 30, 40, 50, 60 мг белка в 10см3. Из полученных растворов отбирают в пробирки по 0,1см3, добавляют 2,4см3 раствора мочевины и 2,5см3 биуретового раствора и ведут определение описанным выше методом. Калибровочный график представлен на рисунке 3