Одним из промышленно важных ферментов, продуцируемых микроорганизмами, являются липазы, которые интенсивно исследуются во всем мире. Липаза - триглицеридгидролаза - фермент, катализирующий гидролиз жиров, широко распространена в природе. Она присутствует в животных и растительных клетках, а также в микроорганизмах. Экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что микробные липазы являются ферментами с широкой специфичностью и большим разнообразием свойств. Свойства липаз и характер липолитической активности даже у одного рода можно различно варьировать. Изучение микробных липаз представляет большой теоретический и практический интерес, так как они могут быть использованы при гидролизе разнообразных жировых субстратов [15].
Липазы катализируют гидролиз жиров и масел с образованием диацилглицеридов, моноацилглицеридов, глицерина и жирной кислоты. Катаболизм включает три основных фазы превращения органических веществ органотрофами. В первой фазе, с помощью экзоферментов бактерии гидролизуют липиды до жирных кислот и глицерина, которые могут легко транспортироваться в цитоплазму. Во второй фазе, поступившие в цитоплазму органические вещества расщепляются до фрагментов, содержащих два-три углеродных атома. В третьей фазе эти соединения окисляются до углекислого газа и воды. Наибольшая часть энергии высвобождается во второй и третей фазах [11].
Липазы можно разделить на две группы: специфичные и неспецифичные. Ферменты из первой группы гидролизуют сложноэфирные связи в первом или втором положении. Многие микробные липазы обычно гидролизуют первичные сложноэфирные связи (a-эфирные связи). В гидролизиатах с участием таких ферментов обычно обнаруживаются жирные кислоты, 2,3- и 1,2-диглицериды, 2-моноглицериды. При более длительных гидролизах жирнокислотный остаток из 2-моноглицерида мигрирует в первое положение с образованием 1-моноглицерида, который легко гидролизуется специфичной липазой с образованием глицерина и жирной кислоты. К этой группе относятся липазы из Rhizopus arrhizus, Rhizopus delemar, Rhizopus microsporus, Mucor miechei, Aspergillus niger, Pseudomonas sp. и т.д. Липазы второй группы не различают эфирные связи во всех трех положениях триглицеридной молекулы и способны подвергать субстрат тотальному гидролизу. В гидролизатах триглицеридов с участием этих видов липаз обнаруживаются, как правило, остатки триглицеридов (негидролизованная часть), глицерин и жирные кислоты. Такие липазы были выделены из Geotrichum candidum, Oospora lactis, Humicola lanuginosa и т. д. Активность липаз зависит от длины цепочки и степени насыщенности жирной кислоты. Дженсон описал, что липаза Geotrichum candidum проявляла высокую специфичность к олеиновой и линолевой кислотам независимо от их положения в молекулах триглицеридов. Такими же свойствами обладают липазы из Achromobacter lipolyticum, тогда как липаза из Aspergillus niger проявляла большую специфичность к стеариновой кислоте и молекулам субстратов [16].
Важное значение при исследовании жиров приобрели спектральный метод, метод радиоактивных изотопных индикаторов, молекулярные перегонки и др. Все они представляют интерес, так как для их осуществления требуется очень небольшое количество исследуемого материала, а точность результатов очень высока.
Спектральный анализ при исследовании жиров проводят в видимой области спектра с длиной волн 400—750 нм, в ультрафиолетовой области с длиной волн 200—400 нм и в инфракрасной области с наибольшей длиной волн 2000—15000 нм.
Спектральный анализ применяется для количественного определения в жирах ненасыщенных кислот, некоторых продуктов окисления жира, синтетических ингибиторов окисления жиров и для многих других целей.
В состав большинства натуральных жиров и масел входят ненасыщенные кислоты с изолированными двойными связями. Поэтому для определения содержания в них линолевой и линоленовой кислот смесь кислот изомеризуют.
Инфракрасная спектрометрия применяется для установления деталей строения структурных элементов жиров, строения сопутствующих жирам веществ, для определения содержания в гидрированных и модифицированных жирах транс-изомеров олеиновой кислоты, для определения содержания первичных и вторичных спиртов в смеси и для других целей.
Хроматография — метод разделения веществ, заключающийся в пропускании газовых смесей или растворов через слой пористых сорбирующих материалов.
Хроматографический анализ получил большое применение для разделения и количественного определения сопутствующих жирам веществ, жирных кислот, продуктов окисления жиров, высокомолекулярных жирных спиртов и для многих других целей.
В области исследования жиров наиболее широко распространены адсорбционная и распределительная хроматография. В последнее время широкое распространение в исследовании липидов получила газо-жидкостная хроматография.
Газо-жидкостная хроматография отличается от других видов распределительной хроматографии в основном тем, что в качестве подвижной фазы используется инертный газ (гелий, водород), а неподвижной фазой является жидкость, нанесенная на твердый носитель. Разделение смеси на индивидуальные вещества производится в колонке, заполненной порошком, например, кизельгуром, цеолитом, равномерно пропитанным небольшим количеством нелетучей жидкости, служащей неподвижной фазой.
С помощью газожидкостной хроматографии можно с большой точностью анализировать смеси метиловых эфиров насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, смеси жирных спиртов и других веществ [6].
1.2 Современные методы обезжиривания
Обезжиривание — один из основных процессов производства меха. Значение обезжиривания для мехового производства велико: на поверхности волосяного покрова и в кожевой ткани шкурок некоторых видов животных (овец, нутрий, сурков, тюленей, ондатр, морских котиков и т.д.) содержится значительное количество жироподобных веществ. Высокое содержание жироподобных веществ в волосяном покрове является причиной дефектов крашения (непрокрас, пятнистость), ухудшения блеска и рассыпчатости волосяного покрова, а наличие большого количества жира в кожевой ткани в определенных условиях приводит к его окислению и снижению прочности кожевой ткани.
Установлено, что после отмоки па волосяном покрове меховых шкурок содержится значительное количество липидов. Загрязнений белковой и углеводной природы [17].
Обезжиривание должно вестись до содержания жира в волосе в пределах 1,5-2 % (считая на влажность 0%). При более низком содержании жира ухудшаются физико-механические свойства волоса, появляются хрупкость и ломкость, снижается устойчивость его к истиранию.
Известно несколько методов обезжиривания:
Адсорбционный метод основан на применении высокодисперсных твердых адсорбентов (специальных глин). Мельчайшие частицы глины обволакиваются капельками жира и удаляют его. Этот метод малопроизводителен, поэтому почти не применяется [18].
Обезжиривание растворителями – экстракция полуфабриката растворителями жира (дихлорэтаном, бензином, уайт - спиритом, скипидаром). Достоинством этого метода является высокая степень обезжиривания дермы, гарантия от теклости волоса. Однако относительно высокая стоимость растворителей, их токсичность и сложность аппаратуры ограничивают применение этого метода. Кроме того, шерсть очень сильно адсорбирует растворитель. Разрабатываются методы обезжиривания водными эмульсиями жирорастворителей.
Эмульсионный метод обезжиривания имеет наиболее широкое применение как в меховой, так и в кожевенной промышленности. Он основан на использовании моющей способности ПАВ: ОП-10, сульфанола НМ-3, сапонина, мыла, порошка и пасты «Новость» и др. [19].
Ферментативный метод обезжиривания волосяного покрова овчины осуществляется с помощью таких ферментных препаратов, как липазин, липаваморин Г-3х и липопротеидлипаза [18].
В основном их применяют с целью придания кожевой ткани меха мягкости и пластичности за счет удаления межволоконных веществ, в частности белков, углеводов и их комплексов. Основные проблемы и трудности проведения обезжиривания с использованием ферментов заключаются не только в ослаблении связи волосяного покрова с дермой, но в том, что в рабочем растворе присутствуют синтетические поверхностно-активные вещества (СПАВ) и формальдегид, которые вызывают снижение активности применяемых ферментных препаратов.
В современных методах обезжиривания основное внимание уделяется только технологической стороне процесса, а именно, степени удаления жировых веществ с поверхности волосяного покрова и кожевой ткани. При этом не учитывается уровень техногенного воздействия, оказываемого на окружающую среду и, в частности, на водные объекты. Высокая токсичность сточных вод после процесса обезжиривания обусловливается присутствием в них СПАВ и формальдегида.
Для выполнения работы была использована культура рода Pseudomonassp., выделенная из сточной воды после эмульсионного метода обезжиривания меховой овчины. Чистую культуру поддерживали на синтетических, элективных, агаризованных питательных средах, ее введение осуществляли в соответствии с общепринятыми микробиологическими методами [20].
Биотехнологическое обезжиривание проводили в течение 1 ч при температуре (40+0,5)ОС при переменном механическом воздействии. Для испытаний использовали состав, содержащий неионогенный СПАВ - Превоцелл W-ОF-7 - 0.12 г/дм3; бактериологический препарат - 2.5 г/дм3; с активностями протеолитической - 212 ед./г и липолитической - 11,42 ед./г; биомассой микробных продуцентов 36х104 клеток/см3. В опытный состав не вводили формальдегид и карбонат натрия. В качестве контрольного варианта было проведено обезжиривание по типовой методике. Полученный после опытного обезжиривания полуфабрикат характеризовался белым, чистым, рассыпчатым волосяным покровом. Содержание органически вымываемых веществ в кожевой ткани и волосяном покрове после опытного обезжиривания составило 13,87 и 2,0% соответственно.