Механізми інактивації потенціал-залежних К+ каналів (стр. 2 из 3)

Isacoffetal. встановили, що мутації в цитоплазматичній петлі, яка приєднує трансмембранні домени S4 і S5 спричинюють дикий тип інактивації в ShakerBі drk1, в яких інактивація індукується додаванням ShakerB - кулькових пептидів з внутрішньої сторони плазматичної мембрани. Відповідаючи дослідженням з кульковим пептидом, гідрофобний залишок має особливе значення для стабілізації інактивованого стану. Мутації цієї ділянки також змінюють властивості йонної провідності, з чого можна припустити їхній близький зв'язок з канальними структурами, через які перебігає йонний струм.

Деякі автори пропонують вважати, що близькість залишків, задіяних в процесі швидкої інактивації до S4 домену може створювати основу тісного зв'язку між активацією та інактивацією. Конформаційні зміни внаслідок вилучення заряджених залишків S4 спіралі можуть збільшувати афінність кульки до її рецептора. На підтримку взаємодії між доменами, задіяними в процесах активації та інактивації, Bozanillaпоказав, що присутність інактиваційної частинкиShakerB каналів сповільнює переміщення воротних зарядів під час припинення деполяризаційних пульсів. Ці результати змушують думати про можливість конформаційних перебудов, а не просто взаємодію кульки з рецепторами в процесах активації та інактивації.

Механізм блокування кульковим пептидом.

Як зазначалося вище, інактиваційна частинка поводиться схоже на блокатор йонного струму. Це було продемонстровано, використовуючи ТЕА блокатори К⁺ каналів в гігантському аксоні кальмара. Для того, щоб зрозуміти механізм блокування інактиваційною частинкою, необхідно повернутися до класичної біофізики.

Armstrong встановив, що внутрішньоклітинний ТЕА блокує лише канали у відкритому стані, що пов'язується з думкою про те, що ТЕА глибоко проникає в середину каналів, перекриваючи потік йонів. Така ідея протилежна до думки про можливу алостеричну дію, яку виявляє ТЕА, індукуючи довготривалі конформаційні зміни і порушення провідності йонів через канальні структури.

Виходячи з припущення про локалізацію блокатор-зв'язуючої ділянки, можна прогнозувати, що збільшення йонного струму через канал здатне дестабілізувати взаємодію блокатора з каналами і таким чином пом'якшувати блокаду.

Властивості інактиваційної частинки ShakerB як блокатора відкритих каналів також були продемонстровані.

DemoandYellen показали, що час відновлення від інактивації (тобто час, потрібний для того, щоб канальний білок повернувся від інактивованого стану до закритого неінактивованого стану) скорочується за присутності високих концентрацій К⁺ в зовнішньому середовищі. Це узгоджується з ідеєю про "пом'якшення інактивації".

Експерименти з ізольованими каналами підтвердили точку зору про те, що канали інактивуються у відкритому стані. Точніше, для того, щоб інактивуватись, канал спочатку має відкритися, а після приєднання, інактиваційна частинка заважає каналові повернутися до закритої конформації. Отже, просту кінетичну модель актиації можна зобразити таким чиом: С-О-І. Для того, щоб перейти від інактивованого до закритого стану, каналові необхідно відкритися. (мал.2) Інактиваційний ShakerB кульковий пептид поводиться як блокатор відкритих каналів.

Стехіометрія інактиваційної реакції.

З вищесказаного випливає очевидність того, що потенціал-залежні канали - це тетрамери, утворені ідентичними чи змішано - незалежними субодиницями. Коли це так, то кожен канал має 4 незалежні NH₂ - кінці, потенційно здатні бути інактиваційними частинами. Скільки їх потрібно, щоб відбулася інактивація?

MacKinnonetal. підійшли до цього питання створюючи субодиничні форми Shaker, в яких присутність інктиваційної кульки була пов'язана з мутацією, що робить канал стійким до блокади СТХ, але не має відношення до інактивації. Цю форму каналу ін'єктували в ооцити Xenopuslaevisразом з токсин-нечутливими неінактиваційними субодиницями, і очікувалась експресія тетрамерів з хаотичним випадковим складом. Достатньо лише одного токсин-зв'язуючого сайту, щоб підтвердити чутливість до токсину, коли лише однієї кульки достатньо для інактивації каналу, тоді всі токсин-чутливі канали з вбудованими 1-4 токсин чутливими субодиницями, які несуть кульки, мають інактивуватися.

Насправді, всі швидко інактиваційні компоненти, індуковані ін'єкцією змішаних субодиниць, блокувалися СТХ. Однак інактивація каналів, які містили менше ніж 4 інактиваційні частинки, була повільнішою ніж у тих, які містили всі 4 кульки. Такі дані можна трактувати аналогічно до доза-залежного рівня інактивації ShBD6-46 каналів, на які діяли вільним кульковим пептидом, при чому зростання інактиваційного рівня відбувалося коли пептид був більш позитивно зарядженим. В будь-якому разі припускається, що збільшення концентрації кулькового пептиду біля його рецептора, збільшує вірогідність їхнього зв'язку і відтак - рівня інактивації; тим не менш, лише одна кулька взаємодіє з гирлом каналу.

b - субодиниця швидкої інктивації.

Більшість досліджень молекулярного та біофізичного механізмів швидкої інактивації К⁺ каналів зосереджувалось навколо NH₂ кінцевого домену а- субодиниці канального білку. Однак, деякими авторами було також висловлено думку про те, що білкові домени з інших субодиниць можуть спричинювати швидку інактивацію неінактивованих каналів, коли їх експресувати разом з а- субодиницею.

Rettingetal. ідентифікували клони цДНК, які кодують 2 ізоформи В- субодиниць К⁺ каналів мозку щурів. Коекспресія одного з них К_VB1 з мРНК, що кодує RCK1 веде до експресії швидко інактивованого струму, на відміну від експесії самого RCK1, який не інактивується. Так само, коекспресія К_VB1 і RCK4 прискорює у 8 разів інактивацію експресованого окремо RCK4.

Експериментальна очевидність пітверджує ідею про те, що NH₂кінцева форма К_VB1 субодиниці утворює інактиваційну частинку (В-кульку), що поводиться так само, як і ShakerBпептид. К_VB1 NH₂ кінець має подібну первинну структуру з NH₂ кінцем інактиваційних К⁺ каналів ссавців (і родиною Shakerдрозофіли). Ця подібність включає кластер гідрофобних амінокислот та групу заряджених залишків. Делеція К_VB1 NH₂ кінця унеможливлює швидку інактивацію при коекспресії з RCK1, а додавання відповідного пептиду всередину клітини, відновлює її.

Як і у випадку з ShakerB пептидом, інактивація за допомогою b-кульки зростає при збільшенні позитивного заряду кульки. Більше того, коекспресія K_Vb1 з ShBD6–46 веде до виникнення інактиваційних К⁺ струмів. Виявляється, що b-кулька може повністю повторювати функції раніше описаної NH₂ – кінцевої ділянки a субодиниці. (мал.2, мал.3) Природньо припустити, що обидві “кульки” взаємодіють з одним тим самим сайтом на внутрішньому гирлі каналу, оскільки обидві мають гідрофобний профіль і b- інактивація дестабілізується підвищенням концентрації К⁺ назовні клітини, що відбувається при класичному N-типові інактивації.

Можливість комбінування різних ізоформ a чи b- субодиниць в К⁺ каналах розглядається як спосіб фізіологічної модуляції інактивації К⁺ каналів invivo.

С- тип інактивації.

Ми вже розглянули N-тип інактивації, яка відбувається швидко, однак, виявляється, що багато К⁺ каналів демонструють іншу форму інктивації – повільну.

Робота Hoshietal. показала, що саме СООН- кінцевий домен бере участь в цьому типові інактивації (інактивації за С-типом). Ця ідея виникла після спостереження того, що альтернативно сплайсовані С-кінцеві варіанти показували різний рівень повільної інактивації. Iverson & Ruby також помітили, що різні С – кінці впливають на стабільність довготривалого інактивованого стану в різних конструктах Shaker. Інші дослідження показали, що С- інактивація відбувається принципово іншим чином, ніж N- інактивація.

Внутрішньоклітинний ТЕА, що конкурує за зв’язування рецептора на внутрішньому гирлі каналу з кульковим пептидом, не впливає на повільну інактивацію. Але зовнішній ТЕА сповільнює С- інактивацію та зменшує макроскопічний струм у ShBD6–46 мутантів. Рівні інактивації мають лінійну залежність від концентрації ТЕА іззовні, і амплітуди струму також пропорційно зменшуються. Цей вплив ТЕА на С- тип інактивації відповідає моделі “нога в дверях”. Оскільки трипсин не виявив ніякого впливу на зовнішній бік каналу при С- інактивації, механізм “кульки й ланцюжка” було виключено. Тоді дослідники висловили припущення, що при С-типові інактивації відбуваються більш значні структурні перебудови з зовнішнього боку мембрани. Хоча деякі експерименти з реєстрацією струмів у дикого типа ShBD6–46 і підтвердили справедливість моделі “footinthedoor”, однак інші дослідження показали, що ефекти проникливих йонів на С-тип інактивації не можна розглядати за такою спрощеною схемою.

Наприклад, Lopez-Barneoetal. зробили низку амінокислотних замін в ShakerВ каналах, які не мали N- типу інактивації і виявилося, що найдраматичніші наслідки для інактивації за С- типом мала заміна в Т449К мутанта, коли рівень інактивації зменшувався в 42 рази порівняно з нормальними каналами. Таким чином, амінокислотний залишок в 449 положенні виявляється критичним для визначення рівня інактивації. З іншого боку Lopez-Barneo помітив, що зовнішні катіони на додаток до того, що вони сповільнюють С-тип інактивації, можуть також впливати на кількість каналів, які відкриваються при деполяризації. Цей ефект більше проявлявся у тих мутантів, які характеризувалися більш швидкою С- інактивацією, а саме у Т449А, Т449Е, Т449К. В цих трьох випадках величина пікового струму на стільки залежала від зовнішньої концентрації К⁺ , що струм зовсім не виникав за відсутності К⁺ . Pardo та співробітники помітили, що калієвих струмів, індукованих K_V1.4 в ооцитах Xenopus зовсім не виникало при заміні зовнішнього К⁺ на непроникні катіони. Цей ефект опосередкований зниженням кількості каналів, здатних до відкривання.