Механізм дії високого тиску і температури на деякі мікроорганізми та вітаміни (стр. 2 из 5)

- IV й VI Міжнар. наук. конф. асп. і студ. «Охорона навколишнього середовища й раціональне використання природних ресурсів» (Донецьк, 2005, 2007),

- IX Міжнар. конф. «Високі тиски - 2006» (Судак, 2006),

- IV з'їзд Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006),

- III Всеукраїнська науково-технічна конференція «Фізика. Біофізика - 2007» (Севастополь, 2007).

Публікації. За результатами досліджень, що увійшли до дисертації, опубліковано 16 наукових праць, у тому числі 7 статей у фахових журналах, 9 – тез доповідей на національних та міжнародних наукових конференціях і з’їздах.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається із вступу, чотирьох розділів і висновків. Основний текст викладено на 131 сторінці машинописного друку. Дисертація містить 24 таблиці і 31 рисунок. Список використаних джерел містить 171 найменування. Робота має 1 додаток на 2 аркушах. Повний обсяг дисертації складає 151 сторінку.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми, сформульовано мету, задачі, об’єкт, предмет та методи дослідження, вказано зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами, наукову новизну і практичне значення отриманих результатів, особистий внесок здобувача, відомості про апробацію та публікацію результатів.

Розділ 1 присвячено огляду та аналізу літератури за темою дисертації, зокрема опису нової технології стерилізації продуктів харчування надвисоким тиском, історії її створення, перевагам. Як витікає з літературних даних, розвиток нової технології стримують невизначеність у виборі фізичних параметрів обробки і відсутність її стандартів.

Розглянуто особливості дії високого тиску на мікроорганізми, а також фактори, що впливають на стійкість бактерій до високого тиску (тип мікроорганізмів, умови їхнього росту й вік, кислотність середовища, склад харчових продуктів, температура). Літературні дані що до чутливості різних мікроорганізмів до дії тиску, як і до параметрів обробки харчових продуктів, що використовуються для інактивації мікроорганізмів, істотно різняться.

Крім того в огляді літератури розглянуто відомі механізми інактивації мікроорганізмів високим тиском, а також наведено дані про дію тиску на білки, зміну кислотності середовища під тиском, і її вплив на процес інактивації мікроорганізмів.

Огляд літератури свідчить, що дотепер немає єдиної теорії, яка б пояснювала все розмаїття явищ, що відбуваються в біологічних і хімічних матеріалах під дією високого тиску. Немає і сталих уявлень щодо механізму інактивації мікроорганізмів під дією тиску.

У розділі 2 описані матеріали і методи експериментального дослідження. Об’єктами, які зазнавали дію високого тиску, були зразки вишневого соку та яблучного пюре, а також вітамін С в буферних розчинах з рН від 4 до 6. Вимірювання проводилися у діапазоні тисків від 0 до 600МПа при температурах від 20 до 45°С. Тривалість дії тиску становила від 5 до 20 хвилин і здійснювалась на експериментальній установці високого тиску в ДонДУЕТ. Мікробіологічний аналіз зразків, що оброблялись високим тиском, та визначення концентрації вітаміну С виконувалися за методиками, що відповідають ДСТУ.

У розділі 3 наведені результати спільної дії тиску, температури й часу обробки на кількість виявлених мікроорганізмів і концентрацію вітаміну С у вишневому соку та яблучному пюре, а також результати модельних експериментів над чистим вітаміном С у розчинах різної кислотності.

Подано результати досліджень впливу тиску на мікробіологічні показники (інактивацію МАФАМ і цвілі) і вміст вітаміну С у вишневому соку.

Показано (рис.1), що тиск біля 500МПа є граничним для інактивації мікроорганізмів і цвілі. У той же час спад концентрації вітаміну С є незначним, (з ростом тиску від 300 до 500МПа він становить ~10% при t=10хв, T=25°C й ~50% при t=20хв, T=45°C).

Підвищення температури так само, як і збільшення тривалості дії тиску та температури приводить до суттєвого зменшення числа мікроорганізмів в інтервалі тисків від 300 до 500МПа. Зменшення концентрації вітаміну С при цьому однакові для зазначених тисків.

У роботі досліджено вплив високого тиску на зміст МАФАМ у яблучному пюре (Рис. 3), вивчено кількісний й якісний склад мікрофлори.

В модельних експериментах з обробки надвисоким тиском розчинів вітаміну С при різних кислотностях встановлено (Рис. 2), що вплив високого тиску на розчини з більшим рН приводить до більшої деградації вітаміну С. До такого ж ефекту веде збільшення часу обробки тиском. В розчинах з більшим рН спостерігається уповільнення швидкості падіння концентрації з ростом тиску.

Отримані результати що до впливу тиску, температури й часу витримки на деякі компоненти харчових продуктів узгоджуються з даними інших авторів і можуть бути використані для побудови феноменологічної моделі процесу обробки високим тиском.

У розділі 4розглянуто фізичні основи явища деградації біосистем під дією тиску. При порівнянні отриманих даних що до інактивації мікроорганізмів із відомими з літератури кривими денатурації білків під тиском виявлена кореляція між ступенем інактивації мікроорганізмів і ступенем денатурації білків, що свідчить на користь ключової ролі денатурації білків у механізмі інактивації мікроорганізмів.

Кінетику інактивації мікроорганізмів і денатурації білків під дією сталих підвищеної температури й тиску можна розглядати як незворотну хімічну реакцію першого порядку. Зміна концентрації мікроорганізмів, що вижили, і не денатурованих білків в залежності від часу C(t) описується рівнянням розпаду:

, (1)

рішенням якого є:

(2)

де

– імовірність переходу біомолекули або мікроорганізму в пошкоджену форму в одиницю часу. У відповідності до теорії активованого комплексу, розглядаючи вказаний перехід як одновимірний процес активаційного типу, маємо:

, (3)

де W– висота енергетичного бар’єру, що відокремлює нативний та денатурований стани. Висота вказаного енергетичного бар’єру дорівнює мінімальній роботі, яка затрачується при переході з нативного стану на вершину енергетичного бар’єру, тобто:

, (4)

де Р₀ і Т₀ – температура і тиск у барокамері, ΔE, ΔS, ΔV– зміна енергії, ентропії та об’єму зразка.

При ΔV<0 вільна енергія реакції зменшується з ростом тиску, що відповідає зрушенню хімічної рівноваги убік збільшення кінцевого продукту у повній відповідності із принципом Ле-Шательє. Таким чином, зовнішній тиск P впливає на рівноважне співвідношення концентрацій у нативному N і денатурованому D станах через доданок Р₀ΔV у термодинамічному потенціалі, а також впливає на швидкість денатурації через зміну активаційного бар'єра (U + Р₀ΔV, де U= ΔE– Т₀ΔS).

Рішенням системи рівнянь (2)-(4) методом найменших квадратів винайдено набір {ln(A), U й ΔV}, при якому теоретичні криві щонайкраще проходять через всі експериментальні крапки. Цінність цього рішення полягає в тому, що за допомогою всього лише трьох параметрів описана реакція системи на будь-яке сполучення зовнішніх впливів тиску P, температури T й тривалості їхньої дії t. Непрямим підтвердженням правильності отриманих параметрів є близькість за порядком величини U та ΔV МАФАМ і цвілі до відомих значень для різних білків. Отримана зміна молярного об'єму ΔV для невеликої молекули вітаміну С по модулю на порядок менша, ніж характерні значення цього параметру для мікроорганізмів або для білків.

На Рис. 1 представлено криві, що розраховані з використанням винайдених параметрів, в порівнянні з експериментальними даними. Теорія цілком задовільно описує експеримент, зокрема, криві передають правильний хід концентрації залежно від тиску як для вітаміну С, так і для МАФАМ і цвілі, а також правильно відображають тенденції зміни цих залежностей при зростанні температури й часу обробки. У рамках однієї й тієї ж формули утворюються як плавно спадаючі майже лінійні залежності для вітаміну С, так і східчасті криві для МАФАМ і цвілі.

Тим самим проведені розрахунки, з одного боку, підтверджують правильність обраної моделі, а з іншого – дають можливість планувати експеримент і вибирати оптимальні значення параметрів обробки для максимальної стерилізації продуктів при найкращій збереженості вітаміну С.

Досліджено вплив високого тиску на кількість мікроорганізмів групи МАФАМ у яблучному пюре, тобто знайдені значення параметрів ln(A·1сек)=13.2, U=13.4ккал/моль та ΔV=-25.1мл/моль, які є близькими до значень відповідних величин, що отримані для вишневого соку. На Рис. 3 представлені експериментальні й теоретичні значення відносних чисел КУО МАФАМ (з двох серій дослідів T=30°С, t=20хв і T=25°С, t=10хв), отриманих для яблучного пюре, а також криві, що розраховані для вишневого соку у тих же умовах. Має місце цілком задовільна якісна згода теорії з експериментом. Крім того, в обох випадках наявне помітне зрушення убік менших тисків (приблизно на 150МПа) кривих для яблучного пюре порівняно з кривими для вишневого соку. Таке зрушення кривих убік менших тисків обумовлюється різними значеннями кислотності в яблучному пюре (pН=5.3) і у вишневому соку (pН=6.1). Як відомо, процеси денатурації білків й виживаність мікроорганізмів визначаються, насамперед, кислотністю середовища, швидкість інактивації мікроорганізмів тиском росте зі зниженням рН.