Анализ, проведенный Льюисом, показал, что существует линейная зависимость частоты CMGT-трансфекции от дозы донорных хромосом. В большинстве последующих экспериментов исследователи старались ввести в клетку как можно больше хромосом. Однако на практике количество хромосом, которое можно получить, ограничено. Основное препятствие в использовании очень большого количества донорных клеток – это высокая вязкость суспензии хромосом, которая способствует их агглютинации. Вот почему мы добавляем не более 20 хромосом на одну реципиентную клетку. Помимо механического воздействия для получения препарата хромосом можно применять и химическую обработку, включая использование мягких детергентов, таких, как дигитонин.
Исходя из нашего опыта, можно заключить, что результаты трансфекции воспроизводимы. В некоторых случаях может оказаться необходимым оптимизировать условия «шока», варьируя концентрацию глицерина и время инкубации. Обсуждение способа трансфекции с помощью осаждения фосфатом кальций приводится в разд. 6.
При использовании метода CM.GT образуются реципиентные клетки, содержащие фрагменты донорных хромосом: в некоторых случаях они встраиваются в геном реципиента, иногда реплицируются самостоятельно. Невозможно выделить параметр, контролирующий размеры передаваемого фрагмента, и в большинстве экспериментов получаются клоны, содержащие донорный материал в широком диапазоне. Мы детально анализировали введенные фрагменты во всех случаях. В них наблюдались перестройки: это либо внутренние делеции, либо переобогащение альфоидными последовательностями из области центромеры. Внутренние делеции описаны также другими авторами.
4. Перенос генов, опосредованный ДНК
4.1 Введение
В настоящее время разработано большое количество методов для введения клонированных последовательностей ДНК в клетки млекопитающих. Среди них преципитация фосфатом кальция или DEAE-декстраном, электропробой, использование инактивированных вирусов и слияние прокариотических и дрожжевых протопластов с клетками млекопитающих. Наиболее широкое распространение получила преципитация фосфатом кальция. Точный механизм захвата ДНК, ее включения в реципиентную клетку непонятен, однако известно, что лишь небольшое количество клеток в культуре реципиентов включают ДНК. По аналогии с бактериальной генетикой эти клетки получили название «компетентных». Количество включаемой ДНК – важнейшая характеристика используемой клеточной линии. Мышиные L-клетки включают несколько миллионов пар оснований экзогенной ДНК, человеческие фибробласты – только часть этого количества. Было проведено несколько экспериментов по выявлению максимальных размеров ДНК, передаваемой неповрежденной. Обычно не удается перенести интактную ДНК, размеры которой превышают 100 т. п. н. Неизвестно, зависит ли это от свойств клеток-реципиентов или определяется трудностями в получении таких больших фрагментов ДНК интактными. Недавние успехи в получении высокомолекулярных фрагментов ДНК позволяют проанализировать оба этих варианта.
4.2 Трансфекция ДНК с использованием фосфата кальция
Таблица. Растворы для DMGT
| Среда для роста клеток | Используйте низкофосфатную среду для роста |
| клеток, такую, как DMEM | |
| Селективная среда | |
| 2хНереэ-буфер | рН очень важен и должен быть проверен, если |
| раствор длительно хранился | |
| рН 7,1±0,05 | 50 мМ Hepes |
| 290 мМ хлорида натрня | |
| 1,5 мМ фосфата натрия (равное количество гидро- | |
| и дигидрофосфата) | |
| 1XHBS | 25 мМ Hepes |
| 145 мМ хлорида натрия | |
| 0,75 мМ фосфата натрия (равное количество гидро- | |
| 1,25 М хлорид кальция | и дигидрофосфата) |
| Раствор для глицерино- | 15% глицерина в1XHBS |
| вого шока |
4.3 Совместный перенос и предварительная селекция
Известно, что компетентные клетки способны включать большое количество донорной ДНК, причем одна реципиентная клетка может включать несколько разных молекул донорной ДНК в один геномный сайт. Этот феномен позволяет выделять компетентные субпопуляции из общей массы реципиентных клеток и маркировать геном млекопитающих. Если донорная ДНК смешана с плазмидной, кодирующей селективный для клеток млекопитающих маркер, селекция по плазмидному гену после трансфекции позволяет выделить популяцию трансфицированных клеток. Такое обогащение облегчает дальнейшую очистку реципиентных клеток. Этот прием оказался успешным при клонировании генов, кодирующих клеточные поверхностные антигены. В данном случае для обогащения использовали антитела, а для разделения субпопуляций клеток флуоресцентный сортер.
В реципиентных клетках ДНК плазмиды, содержащей селективный маркер, лигируется с донорной геномной ДНК. Это приводит к «маркированию» последовательности ДНК клетки млекопитающего и может упростить выделение донорного гена после нескольких повторных трансфекции.
В опытах по котрансфекции мы использовали смесь из 1 мкг плазмидной и 20 мкг геномной ДНК. Смесь готовили непосредственно перед добавлением хлорида кальция.
4.4 Возможные ошибки и варианты методики
Не все клетки способны к трансфекции геномной ДНК с высокой частотой. Одни клетки вообще не трансфицируются, другие, например человеческие фибробласты, способны эффективно включать плазмидную ДНК и почти не включать геномную ДНК – Мышиные L-клетки обладают способностью к трансфекции геномной ДНК с высокой частотой и могут быть использованы в качестве положительного контроля в экспериментах по трансфекции ДНК новыми клеточными линиями. Возможно, что альтернативные способы прямого включения геномной ДНК, такие, как электропробой или липосомный перенос, смогут расширить список клеточных линий, способных к трансфекции. В противовес общепринятому мнению мы получали хорошие результаты по трансфекции L-клеток, используя преципитацию, при которой образовывался осадок как в виде слабо опалесцирующей суспензии, так и в форме агрегатов. Тем не менее, конечно, предпочтительнее соблюдать условия, при которых формируется гомогенный осадок.
Глицериновый шок увеличивает частоту трансфекции в 2– 5 раз. Оптимальные условия проведения шока для разных клеток варьируют. В каждом новом случае необходимо подбирать как концентрацию глицерина, так и время инкубации.