2.2 Получение клеточных гибридов с помощью слияния, индуцированного ПЭГ
Таблица 2. Основные растворы, необходимые для слияния клеток
| Среда для роста клетокСреда для роста клеток без эмбриональной телячьей сыворотки | Обычно мы используем среду Игла, модифицированную Дульбекко, с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки, однако состав культуральной среды прямо на процесс слияния не влияет |
| Селективная среда | Культуральная среда, пригодная для селекции гибридных клеток |
| 50%-ный раствор ПЭГ, приготовленный в бессывороточной среде | 5,5 г ПЭГ 4000 н 5 мл бессывороточной среды смешивают и авто-клавируют. Конечный рН доводят до 8,2, раствор нагревают до 37 °С непосредственно перед использованием |
2.3 Возможные ошибки и варианты методики
Некоторые линии клеток сливаются с трудом, если же все-таки необходимы именно такие комбинации, попытайтесь сделать следующее.
1. Варьируйте соотношение родительских клеток в диапазоне 1:10–10:1.
2. Попробуйте разный ПЭГ:
а) поменяйте партию ПЭГ. В наших экспериментах та партия ПЭГ, которая давала хорошие результаты при слиянии одного типа клеток, эффективно работала и с другими. Хорошо зарекомендовавший себя препарат необходимо отделить и аккуратно хранить. По некоторым данным свойства ПЭГ могут быть улучшены использованием растворов, не содержащих солей кальция;
б) варьируйте молекулярный вес. Как правило, повышение молекулярного веса влечет за собой увеличение способности индуцировать слияние. Однако раствор ПЭГ с большим молекулярным весом обладает большей вязкостью, что затрудняет отмывку клеток. Так как ПЭГ является
Для каждой конкретной клеточной линии необходимо подобрать оптимальную концентрацию колцемида и время экспозиции. Образование мини-клеток легко контролируется под фазово-контрастным микроскопом. В удачных экспериментах около 50% всех клеток образуют мини-клетки. Эта частота увеличивается после обработки цитохала-зином В.
Второй день
3. Спустя 16 ч замените среду на среду, содержащую цитоха-лазин В в концентрации 2 мкг/мл; инкубируйте в течение ночи.
4. Исходные градиентные растворы поместите в сосуды с неплотно завинченными крышками и инкубируйте в атмосфере 5% СОг при 37 °С в течение ночи.
5. Заранее нагрейте ротор SW41.
Третий день
6. Приготовление ступенчатого градиента фиколла. Тщательно промойте необходимое количество центрифужных пробирок для ротора SW41 абсолютным спиртом, высушите в перевернутом положении в ламинарном боксе. Приготовьте градиент фиколла, используя уравновешенные исходные растворы.
7. Соберите обработанные колцемидом и цитохалазином клетки и осадите их центрифугированием. Ресуспендируйте в 3 мл 10%-ного фиколла и мягко наслоите на градиент. Заполните центрифужные пробирки раствором без фиколла.
8. Поместите пробирки, содержащие градиент, в нагретый ротор SW41 и поставьте ротор в заранее нагретую до 37 °С ультрацентрифугу.
9. Центрифугируйте 1 ч при 25000 об/мин при 37 °С; используйте минимальное ускорение при разгоне и минимальное торможение, чтобы предотвратить разрушение градиента.
10. Выньте пробирки из центрифуги. Мини-клетки образуют рыхлые полоски в градиенте между 15:16% и 16:17% фиколлом. Осторожно отберите эти полоски, используя стерильную пастеровскую пипетку, вводя ее через верх градиента; поместите мини-клетки в новую, стерильную центрифужную пробирку от ротора SW41 и заполните ее средой для роста клеток. Загрязнение фрагментами цитоплазмы, ядрами и целыми клетками можно контролировать под фазово-контрастным микроскопом.
11. Центрифугируйте при 20 000 об/мин при комнатной температуре в роторе SW41 10 мин при максимальном ускорении и торможении. Эта процедура осаждает мини-клетки и отделяет их от фиколла.
12. Для дальнейшей очистки мини-клеток мы предлагаем три различных приема. Очистка не нужна, лишь когда в распоряжении исследователей имеется четкая система селекции. В этом случае они могут сразу использовать мини-клетки для слияния с клетками-реципиентами.
13. Слияние мини-клеток с целыми клетками. Соберите клетки-реципиенты и отмойте их бессывороточной средой. Добавьте приблизительно 107 клеток-реципиентов к осадку мини-клеток в 2 мл бессывороточной ростовой среды, содержащей 100 мкг/мл фитогемагглютинина. Поместите в пластиковый сосуд с коническим дном и инкубируйте 10 мин при 37 °С.
14. Осадите центрифугированием.
15. Процедуру слияния мини-клеток с целыми клетками проводите с помощью ПЭГ, как указано в соответствующей методике.
3. Перенос генов, опосредованный хромосомами JCMGTJ
3.1Введение
Метод CMGT может быть использован для переноса фрагментов хромосом из ядер клеток одного типа в ядра клеток другого типа. Теоретически клетки любого типа могут быть использованы как в качестве доноров, так и в качестве реципиентов хромосом. Однако на практике возможность применения метода определяется наличием подходящих реципиентных линий, обладающих повышенной способностью акцептировать чужеродную ДНК.
Высокая частота трансфекции может быть достигнута при использовании в качестве реципиентов иммортализованных мышиных клеток. Клеткам хомячка и иммортализованным человеческим клеткам обычно присуща более низкая частота трансфекции. Правда, недавно полученные результаты свидетельствуют о том, что человеческие клетки линии EJспособны трансфицироваться с высокой частотой. В роли донора с одинаковым успехом могут выступать самые разнообразные клеточные линии – как суспензионные, так и субстрат-зависимые. Предпочтительнее использовать в качестве донорных те линии, клетки которых легче культивировать и получать в больших количествах. Ниже описываются общие процедуры, обеспечивающие выделение донорных хромосом и перенос фрагментов этих хромосом в реципиентные клетки путем CMGT.
3.2 Выделение хромосом
В ходе описываемых процедур для предотвращения потерь и поломок хромосом, для обеспечения температурного режима необходимо использовать пластиковые пипетки и пробирки. Клетки блокируют на стадии митоза, митотические хромосомы высвобождают воздействием гипотонического шока и гомогенизацией. Хромосомы очищают дифференциальным центрифугированием.
Таблица. Исходные растворы на CMGT
| Среда для роста клеток и селективная среда | NB. Трансфекцию необходимо проводить в средах с небольшим содержанием фосфатов, таких, как DMEM. Клетки, растущие в средах, обогащенных фосфатами, непосредственно перед проведением трансфекции пересейте на среду, бедную фосфатами. Среды, обогащенные фосфатами, можно использовать при глицериновом шоке |
| Гипотонический раствор | 10 мМ Hepes 3 мМ хлорида кальция |
| Раствор для трансфекции | 25 мМ Hepes 134 мМ хлорида натрия 5 мМ хлорида калия 0,7 мМ дигидрофосфата натрия 5 мМ глюкозы |
| 1,25 М хлорида кальция Раствор для отмывки | 25 мМ Hepes 134 мМ хлорида натрия5 мМ хлорида калия0,7 мМ дигидрофосфата натрия |
3.3 Перенос хромосом
Процесс переноса хромосом в этом случае очень напоминает описываемый в методе DMGT. Хромосомы осаждают на поверхности клеток хлоридом кальция, и спустя несколько часов клетки обрабатывают реагентом, способным перфорировать мембраны. Здесь тоже важно использовать пластиковые пробирки и пипетки. Последовательность действий, которая приведена ниже, разработана Нельсоном.
1. За день перед проведением трансфекции высейте по 5Х Х105 клеток на 10 чашек диаметром 9 см. Используйте низкофосфатную среду, например DMEM.
2. Ресуспендируйте 108 хромосом в 9 мл раствора для трансфекции.
3. Медленно добавьте к хромосомам 1 мл 1,25 М раствора СаС12, одновременно продувая воздух через суспензию хромосом.
4. Инкубируйте 20–30 мин при комнатной температуре для: образования смеси фосфат кальция – ДНК.
5. Добавьте по 1 мл этой смеси к среде в каждую чашку с реципиентными клетками. Инкубируйте клетки с хромосомами 4–6 ч в увлажняющем инкубаторе при 37 °С.
6. Удалите среду и добавьте 10 мл отмывочного раствора.
7. Удалите отмывочный раствор и обработайте клетки 1 мл среды для глицеринового шока в течение 4 мин при комнатной температуре.
8. Отмойте клетки 3 раза промывочным раствором и инкубируйте в течение ночи в неселективной среде для роста клеток.
9. Через 24 ч поменяйте среду на селективную. Меняйте среду на свежую каждые 3–4 дня.
10. Колонии появятся на 14–21-й день.
3.4 Предварительная селекция
При использовании DMGT донорная геномная ДНК обычно переносится вместе с плазмидой, кодирующей доминантный селективный маркер. Предварительная селекция, выявляющая включение плазмидной ДНК, позволяет получить 100-кратное обогащение клетками, содержащими интересующий нас клеточный ген. Аналогичный прием может быть использован и в CMGT. Для проведения котрансфекции необходимое количество плазмидной ДНК добавляют к суспензии хромосом перед преципитацией хлоридом кальция. Обычно мы добавляем плазмидную ДНК в количестве, достаточном для достижения соотношения 20:1. Селекцию проводим спутся 24 ч после хромосомной трансфекции.
3.5 Возможные ошибки и варианты методики
В литературе описано множество методов выделения хромосом из клеток, блокированных в метафазе. Процедуры очистки тоже разнообразны. Одни из них позволяют получить высокоочищенные препараты, другие–грубую фракцию хромосом, загрязненную разными компонентами клетки. Мы предпочитаем использовать для проведения трансфекции именно такие грубые препараты, во-первых, потому что их получение занимает мало времени, а во-вторых, потому что хромосомы при этом оказываются наименее разрушенными.