Явление гистерезиса сильно зависит от типа фосфолипида, поэтому данные по специфичности липидов в отношении активности отдельных мембранных ферментов часто оказываются весьма ненадежными.
Ферметы в везикулах. Часто в исследованиях используют мембранные ферменты, встроенные в бислой замкнутых везикул. Это могут быть либо ферменты insitu, содержащиеся в изолированных природных мембранах, либо очищенные ферменты, встроенные в липосомы. В таких экспериментах возникают свои проблемы. Наиболее очевидная из них связана с тем, что активный центр фермента может находиться внутри везикулы и, следовательно, быть изолированным от растворимого в воде субстрата. С этим связана проблема так называемой скрытой ферментативной активности, выявляемой только после того, как везикулы по тем или иным причинам станут проницаемыми или разрушатся. Это явление часто используют для определения ориентации мембранного фермента в везикуле. Доля скрытой активности прямо соответствует доле фермента, активный центр которого локализован внутри везикулы. При этом можно использовать только такие субстраты, которые не способны проникать через мембрану.
Проблемы другого рода возникают при измерении активности трансмембранных ферментов, которые катализируют реакции, сопровождающиеся транспортом веществ или зарядов через бислой. Примерами таких ферментов могут служить цитохром с-оксидаза, катализирующая перенос электронов через мембрану и транспорт протонов в противоположном направлении, а также разнообразные АТР-зависимые ионные насосы, например Са2+ - АТРа-зы. При встраивании в везикулы преимущественно в одной ориентации относительно внутренней и наружной сторон везикулы такие ферменты создают трансмембранный градиент концентрации веществ или электрический потенциал. Именно в этом и состоит их физиологическая функция. В везикулах с маленьким внутренним объемом, однако, этот градиент будет создаваться очень быстро, что приведет к фактическому уменьшению числа оборотов фермента, если не будут приняты соответствующие меры. Это уменьшение связано с тем, что химическая работа, совершаемая при переносе молекулы, иона или электрона против существующего градиента, увеличивается с увеличением этого градиента. При градиенте выше определенного уровня фермент вообще перестает работать. Система, в которой происходит такое уменьшение активности, называется "сопряженной", а сама эта активность является мерой того, насколько целостны везикулы и в какой мере предотвращена утечка ионов или молекул в направлении градиента, созданного с помощью фермента. Степень сопряжения можно оценить, измеряя активность фермента в условиях, когда градиенту не дают образовываться. Например, градиент электрического потенциала, создаваемый на мембране везикулы цитохром с-оксидазой, можно разрушить, добавив в среду ионофор, увеличивающий ионную проницаемость бислоя. При этом необходимо, чтобы внутри везикулы была высокая концентрация буфера, поскольку в противном случае утилизация протонов внутри везикулы с образованием воды приведет к быстрому и сильному защелачиванию внутренней среды, что может повлиять на ферментативную активность.
Работа некоторых ионных каналов и ферментов прямо регулируется трансмембранным потенциалом. С помощью флуоресцентных и спиновых меток показано также, что при наличии разности потенциалов может существенно увеличиваться микровязкость бислоя. Это тоже сказывается на активности ферментов. И наконец, утверждается, что трансмембранный потенциал влияет на степень агрегации некоторых мембранных белков, но физиологическая роль этого явления неизвестна. Все эти эффекты наблюдаются только на замкнутых везикулах.
Влияние поверхностного потенциала. Большинство биомембран содержат значительное количество отрицательно заряженных фосфолипидов, а следовательно, несут суммарный отрицательный заряд. С этим отрицательным зарядом, распределенным по поверхности мембраны, связан поверхностный электрический потенциал. Он вызывает уменьшение концентрации отрицательно заряженных ионов в прилегающем к мембране слое по сравнению со средней объемной концентрацией и увеличение локальной концентрации положительно заряженных ионов вблизи поверхности мембраны. Поверхностный потенциал, изменяя локальную концентрацию заряженных субстратов и протонов, может довольно существенным образом сказаться на поведении ферментов, активный центр которых локализован у поверхности мембраны. При физиологической ионной силе этот эффект будет проявляться главным образом в области, непосредственно примыкающей к заряженной поверхности мембраны, но тем не менее может оказаться весьма существенным. Влияние поверхностного потенциала проявляется в изменении измеряемой величины Км для заряженных субстратов или в сдвиге рН-зависимости активности фермента, поскольку локальная концентрация любого заряженного вещества будет либо выше, либо ниже, чем концентрация в объеме. Поэтому кинетические характеристики мембранного фермента, встроенного в везикулы, которые получены из разных фосфолипидов и имеют разную поверхностную плотность заряда, могут различаться, и в свою очередь отличаться от свойств фермента, находящегося в нейтральных детергентных мицеллах.
Подобные эффекты наблюдались для некоторых митохондриальных и микросомных ферментов - как insitu, так и встроенных в фосфолипидные везикулы, например для арилсульфатазы С, использующей отрицательно заряженный субстрат, или для моноаминооксидазы, катализирующей превращения катионного субстрата. Изменение липидного окружения /3-гидроксибути-ратдегидрогеназы также влияет на величины Км для NADH. Полагают, что это влияние обусловлено изменением плотности поверхностного заряда.
В заключение отметим, что в литературе активно обсуждалась роль поверхностного заряда тилакоидных мембран как фактора, регулирующего латеральное распределение мембранных белков и взаимодействие между мембранами. В этом случае, однако, поверхностный заряд мембраны определяется главным образом белковыми компонентами, а не липидами. Каж бы то ни было, ясно, что учет поверхностного потенциала совершенно необходим при анализе работы многих мембранных ферментов invivo, а также при реконструировании систем из очищенных компонентов, моделирующих природные структуры.
После того как мембранный фермент очищен, для изучения его каталитической активности желательно, а часто и необходимо реконструировать его с фосфолипидами. Кинетические характеристики многих ферментов insitu и после очистки и реконструкции одинаковы. Несмотря на то что свойства фермента в искусственных системах могут изменяться, изучение очищенных и реконструированных ферментов дает большие преимущества. В частности, а такой системе ие протекают различные конкурирующие реакции, присущие биомембранам. Удается устранить и другие осложняющие исследование проблемы. Использование реконструированной системы позволяет не только охарактеризовать изолированную систему, но и определить минимальное число компонентов, необходимых для проявления тех или иных биохимических активностей. С помощью реконструкции в фосфолипидные везикулы, например, было показано, что за поглощение лактозы клетками Е. coli ответствен только один белок, лактозопермеаза. Аналогичным способом было однозначно определено минимальное число белковых компонентов, необходимых для реконструкции дыхательной цепи Е. coli и системы аденилатциклазного гормонального ответа.
Для встраивания солюбилизированных в детергенте очищенных мембранных компонентов в модельные мембранные системы разработано несколько методов. Чаще всего ферменты встраиваются в однослойные фосфолипидные везикулы. Характеристики же белков, активно или пассивно увеличивающих ионную проводимость мембраны, часто определяют после их встраивания в плоский бислой. Плоские мембраны удобны для электрических измерений, позволяющих определить величину ионной проводимости и прочие производные характеристики, например зависимость доли открытых каналов от приложенного электрического напряжения. В таких системах, однако, трудно или даже невозможно определить биохимические характеристики белка, в частности его каталитические активности, отличные от ионной проницаемости.
Для встраивания мембранного белка в липидную везикулу прежде всего необходимо избавиться от находящегося в препарате белка детергента, который, если он присутствует в значительных количествах, дестабилизирует фосфолипидный бислой. Обычно детергент удаляют уже из смеси белка с фосфолипидом, но в некоторых случаях белок очищают от детергента до начала реконструкции. Для удаления детергента используют гель-фильтрацию, диализ или адсорбцию на поверхности шариков из полистирола. Последний способ применяют в первую очередь для удаления тритона Х-100. Все перечисленные методы довольно эффективны, однако следует иметь в виду, что даже после самых интенсивных обработок в системе обычно всегда остается то или иное количество связанного детергента.
Методы реконструкции можно разделить на две группы.