Рекомбинантные вакцины (Генная инженерия) (стр. 3 из 5)

Эффективность ферментативного лигирования достаточно длинных полирибонуклеотидов сильно варьирует и ее трудно предсказать исходя только из нуклеотидной последовательности сегментов РНК. Наилучшие результаты получены в тех случаях, когда сшиваемые концы полирибонуклеотидов были пространственно сближены за счет комплементарного связывания соседних с ними участков РНК.

Недавно было установлено, что протяженные сегменты РНК (длиной в 200-300 остатков) могут быть с высоким выходом сшиты Т4 ДНК-лигазой. При этом "стыковка" сегментов осуществляется с помощью олигодезоксирибонуклеотида, комплементарного 3'-концу одного сегмента и 5'-концу другого.

Метод химического лигирования основан на активации концевой фосфатной группы одного из двух сшиваемых сегментов РНК водорастворимым карбодиимидом или

Рисунок 2. Схема сшивания двух олигорибонуклеотидов с помощью Т4 РНК-лигазы.

BrCN. В случае BrCN реакция протекает очень быстро и не сопровождается модификацией нуклеотидных остатков, хотя под действием карбодиимидов фосфодиэфирная связь образуется с более высоким выходом. Для того, чтобы обеспечить сближенность сшиваемых концевых нуклеотидных остатков в фрагментах РНК, было предложено использовать олигодезоксирибонуклеотиды, комплементарные обоим фрагментам в месте их стыка.

Химическое лигирование РНК, как правило, проходит с существенно меньшим выходом, чем ферментативное. Однако оно позволяет получать рекомбинантные РНК с необычными типами межнуклеотидной связи (например, пирофосфатной) и необычными нуклеотидными остатками в месте стыка двух фрагментов.

Получение рекомбинантных РНК с помощью рибозимов основано на обратимости реакции самосплайсинга (при отсутствии гуанозина или гуаниловых нуклеотидов). Это предоставляет возможность для встраивания интронной РНК в заданный участок другого сегмента РНК (рис. 3). Фрагмент РНК, в который производится встраивание, должен содержать нуклеотидную последовательность, идентичную нуклеотидной последовательности 3'-концевого участка 5'-экзонного района 26S РНК и соответственно комплементарную той нуклеотидной последовательности в интроне, которая отвечает за специфичность прямой реакции. Фрагмент, в который производится встраивание, берется в избытке.

В настоящее время описанная здесь цепь реакций может быть реализована только для интронной РНК, получаемой из предшественника 26S РНК тетрахимены. Однако можно думать, что конструирование новых рибозимов может существенно расширить возможности этого подхода.

1.2.3. СТРАТЕГИЯ КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ

Векторные молекулы в обязательном порядке содержат маркерные гены, которые после переноса вектора в клетки-реципиенты сообщают им новые свойства. Это может быть устойчивость к антибиотику, которой до трансформации клетки не обладали, или образование фермента, синтез которого в клетках-реципиентах не происходил. Благодаря таким вновь приобретенным признакам клетки с векторными ДНК могут быть легко найдены в популяции исходных клеток. Одновременно могут быть отобраны те клетки, которые содержат векторы со встроенными в них чужеродными ДНК (рекомбинантные ДНК). Для этого встраивание чужеродной ДНК в вектор производится таким образом, чтобы один из маркерных признаков вектора нарушался. Так, например, если бактериальный вектор несет устойчивость к двум антибиотикам, то чужеродную ДНК встраивают в один

Рисунок 3. Схема прямого и обращенного процесса самосплайсинга.

из генов антибиотической устойчивости. И тогда бактерии с рекомбинантной ДНК, в отличие от бактерий с исходным вектором, могут расти в присутствии только одного из антибиотиков.

Другой весьма распространенный пример связан с наличием в векторной ДНК наряду с генами, сообщающими клетке устойчивость к антибиотикам, фрагмента лактозного оперона, обеспечивающего образование в клетках-реципиентах активного фермента b-галактозидазы. Колонии клеток с таким признаком легко обнаруживаются при выращивании их на твердом агаре, содержащем в качестве субстрата b-галактозидазы 5-бром-4-хлор-3-индолил-b-галактозид (X-gal), поскольку его расщепление приводит к образованию бромхлориндола - красителя, окрашенного в голубой цвет. Если же в ген b-галактозидазы этого вектора встроена чужеродная ДНК таким образом, что этот ген оказался нарушенным, то трансформированные им клетки будут образовывать бесцветные колонии. Само же присутствие рекомбинантного вектора в клетках может быть зафиксировано по их устойчивости к антибиотику.

На следующем этапе среди популяции клеток с рекомбинантными векторами необходимо отобрать индивидуальные клоны, содержащие только интересующие нас гены или их фрагменты. Само собой разумеется, что это в принципе возможно только в том случае, если в исходные клетки проникло в среднем по одной молекуле рекомбинантной ДНК. Способ же отбора клонов в значительной степени зависит от природы клонируемого гена.

По-видимому, самым простым является случай, когда клонируемый ген способен комплементировать ауксотрофную мутацию в штамме-реципиенте. В этом случае клетки высеваются на среду, лишенную вещества, необходимого для роста данного штамма, и только клетки, содержащие рекомбинантную ДНК с искомым геном, способны расти на этой среде. Из таких клонов получают гомогенную культуру клеток, которую используют для получения искомого сегмента ДНК, проделывая все операции в обратном порядке (то есть из клеток выделяют вектор, из него вычленяют необходимый фрагмент ДНК и так далее).

Гораздо чаще для отбора необходимых клонов приходится прибегать к методу ДНК-ДНК- или ДНК-РНК-гибридизации. Для этого необходимо располагать "зондами" (индивидуальными молекулами ДНК или РНК или их фрагментами), комплементарными нуклеотидной последовательности клонируемого гена. Это могут быть специально синтезированные олигодезоксирибонуклеотиды длиной в 15-20 остатков, последовательность которых выбрана на основании полностью или частично известной первичной структуры гена или закодированного в нем белка. Это могут быть кДНК, синтезированные на индивидуальных РНК-копиях данного гена (как таковые или в виде отклонированных, то есть существенно умноженных в количестве фрагментов ДНК). Наконец, это могут быть сами индивидуальные РНК, закодированные в данном гене. Ясно, что во всех случаях "зонды" должны нести радиоактивную метку (обычно ³²Р) с достаточно высокой удельной активностью.

Если же индивидуальный "зонд" недоступен, то применяют методы, которые из большого числа рекомбинантов (10⁶) позволяют выбрать сравнительно небольшую группу (около 10²), включающую рекомбинант с искомым геном. Эта группа подразделяется на подгруппы (например, на 10) по 10 рекомбинантов. Из каждой подгруппы выделяется ДНК, которую используют для синтеза мРНК и последующей трансляции ее с целью обнаружения соответствующего продукта искомого гена.

Трансляция мРНК может быть осуществлена в бесклеточной системе. Однако в случае эукариотических генов мРНК часто переносят в ооциты лягушки (ксенопуса) с помощью техники микроинъекции, где она транслируется. Продукт трансляции обычно обнаруживают с помощью антител.

Далее в подгруппе, где обнаружен искомый ген, тем же методом исследуется каждый клон.

При наличии зонда с чашки Петри, на которой выращены колонии клеток, делается отпечаток (реплика) на нитроцеллюлозном фильтре. Клеткам дают вырасти на фильтре, затем их разрушают, подвергают ДНК щелочной денатурации и фильтр прогревают при 80°С, после чего ДНК необратимо с ним связывается. Фильтр отмывают от примесей и обрабатывают радиоактивным "зондом" в условиях, оптимальных для ДНК-ДНК- или ДНК-РНК-гибридизации. После удаления избытка "зонда" методом ауторадиографии определяют положение клеточного клона, содержащего участок ДНК с нуклеотидной последовательностью, комплементарной "зонду". Этот клон становится затем источником клеток для получения искомого гена или его фрагмента.

Для селекции клонов, несущих необходимый ген, достаточно широко применяются и иммунологические методы. Принцип отбора на первых этапах тот же, что и при использовании ДНК- и РНК-зондов. Далее с колоний с рекомбинантными ДНК делается реплика с помощью полимерной пластинки, на которой закреплены антитела к продукту искомого гена. Положение клонов, вырабатывающих этот белок, определяется также с помощью антител, но уже меченных радиоактивным йодом (¹²⁵I).

1.2.4. РАЗНООБРАЗИЕ ВЕКТОРНЫХ МОЛЕКУЛ

Под понятием "вектор" понимается молекула нуклеиновой кислоты, способная после введения в клетку к автономному существованию за счет наличия в ней сигналов репликации и транскрипции.

Векторные молекулы должны обладать следующими свойствами:

1) способностью автономно реплицироваться в клстке-реципиенте, то есть быть самостоятельным репликоном;

2) содержать один или несколько маркерных генов, благодаря экспрессии которых у клетки-реципиента появляются новые признаки, позволяющие отличить трансформированные клетки от исходных;

3) содержать по одному или, самое большее, по два участка (сайта) для различных рестриктаз в разных районах (в том числе в составе маркерных генов), но не в области, ответственной за их репликацию.

В зависимости от целей эксперимента векторы можно условно разделить на две группы: 1) используемые для клонирования и амплификации нужного гена; 2) специализированные, применяемые для экспрессии встроенных чужеродных генов. Вторая группа векторов объединяет векторы, призванные обеспечить синтез белковых продуктов клонированных генов. Векторы для экспрессии содержат последовательности ДНК, которые необходимы для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в штаммах клеток.