МакГрат и Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток внутренней клеточной массы бластулы не обеспечивают развития in vitro реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, которая предшествует стадии бластулы. Наибольшая часть (5%) 4-клеточных зародышей даёт возможность развиваться только до стадии морулы. В тоже время 19% реконструированных яйцеклеток 2-ядерных клеточных зародышей, смогли спокойно достичь стадии морулы или бластулы.
Эти и другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей клеточное ядро рано теряет тотипотентность, что связано, очевидно, с очень ранней активизацией генома зародыша – уже на стадиях двух клеток. У других млекопитающих, в частности у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активизация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16 клеточной стадии. Возможно, поэтому первые значительные успехи в клонировании животных были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах.
Тем не менее, особый интерес вызывают опыты группы учёных из университета в Гонолулу во главе с Риузо Янагимачи. Авторам удалось усовершенствовать метод Уилмута, о котором речь пойдёт ниже, они отказались от электрической стимуляции слияния донорской соматической клетки с яйцеклеткой и изобрели такую микропипетку, с помощью которой можно было бы безболезненно извлекать ядро из соматической клетки и трансплантировать его в обезъядренную клетку. Кроме того, авторы использовали в качестве донорских относительно менее дифференцированные ядра клеток, окружающих ооцит. Наконец, удалось, как бы синхронизировать процессы, протекающие в яйцеклетке и трансплантируемом в нём ядре, что позволило обеспечить естественные ядерно-цитолазматические взаимоотношения между ядром и цитоплазмой, поскольку трансплантируемое дифференцированное в определённом направлении ядро и цитоплазма яйцеклетки до того работали как бы в разных режимах.
Авторы использовали для трансплантации ядра клеток, окружающих ооцит (клеток так называемого cumulus oophorus), клеток Сертоли из семенников и клеток, выделенных из мозга. Ядра, выделенные из соматических клеток, инъецировали в энуклеированное яйцо с помощью микропипетки. Яйцо активировали к развитию, поместив в специальный раствор (так называемый HEPES-CZB), свободный от кальция, и добавляя стронций и цитохалазин.Стронций активировал яйцо, а кальций подавлял образование полярных телец. Эмбрионов культивировали до стадии 2-8 клеток, морулы или бластулы, а затем трансплантировали в матку приёмной матери, где многие из них имплантировались и некоторые из них (15-16%) продолжали своё развитие. Процент выхода рождённых мышат (их извлекали с помощью кесарева сечения на 18, 5-19-й дни беременности) был, однако, низок – в разных сериях экспериментов от 2 до 2,8%. Молекулярные исследования доказали принадлежность ядер рождённых мышат к клеткам донора соматических клеток.Таким образом, по крайней мере в некоторых случаях доказана способность ядер соматических клеток обеспечивать нормальное развитие млекопитающих.
Тем не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу, значительно расширили наши представления о методологии млекопитающих.
Кролики и коровы.
Американские исследователи Стик и Робл, используя метод Солтера и МакГрата, получили шесть живых кроликов, пересадив ядра 8-клеточных эмбрионов одной породы в лишённые ядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип родившихся полностью соответствовал фенотипу донора.
Однако только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не позволяющий рассчитывать на получение таким способом клона генетически идентичных животных. Ценность этой работы, тем не менее, в том, что она показала возможность клонирования эмбрионов кроликов.
Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или овец, идёт несколько по-другому. Их сначала культивируют не in vitro, а in vivo – в перевязанном яйцеводе овцы – промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента – коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит до развитого детёныша. Уиландсин предложил заключить реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он потом трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы или коровы. По данным одних авторов реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеводе, чем в культивированной среде, хотя некоторые исследователи получили неплохие результаты и при культивировании in vitro.
Американцы Робл и его сотрудники использовали щадящий метод извлечения ядра без прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенные МакГратом и Солтером, пересаживали в зиготы так называемые кариопласты – мужской и женский пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2-, 4- или 8-клеточных эмбрионов коровы. Сначала пронуклеусы центрифигурировали, чтобы освободить пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хорошо видны под микроскопом, что значительно облегчало их удаление. При помощи манипулятора и заострённой стеклянной пипетки извлекали один из бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей и переносили его в энуклеированную зиготы
Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и пересажены в перевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их вымывали, освобождали от агара и исследовали. Реконструированные зародыши в этом случае развивались только в тех случаях, где зиготы в зиготы пересаживали пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или бластулы. Два зародыша были пересажены второму реципиенту – в матку коровы и развитие их завершилось рождением живых телят. Если в качестве доноров использовали ядра 2-, 4- и 8-клеточных зародышей, то реконструированные яйцеклетки не развивались даже до стадии морулы
Позже были и более успешные работы. Уиландсин, в частности, сообщил, что ему удалось получить четырёх генетически идентичных бычков холстейской породы в результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластул одного 32-клеточного зародыша. Автор утверждал, что большинство ядер сохраняют тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительная их часть 64-клеточной стадии, обеспечивая нормальное развитие реконструированных яйцеклеток до стадии морулы в яйцеводе. После пересадки в матку коров – окончательных реципиентов. Как полагает автор, они могут и дальше нормально развиваться.
Бондиоли и соавторы, используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные зародыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых телёнка. Семь из них были генетически идентичны, представляя собой клон, полученный в результате пересадки ядер клеток одного донорского эмбриона.
Таким образом, клеточные ядра зародышей крупного рогатого скота достаточно долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие реконструированных яйцеклеток. Иначе говоря, методические трудности клонирования зародышей крупного рогатого скота практически решены. Но остаётся основная задача – найти донорские ядра, обладающие тотипотентностью, для клонирования взрослых животных.
Клонирование овец.
Уиландсин ещё в 1986 году показал, что эмбрионы овец на 16-клетоной стадии развития сохраняют свою тотипотентность. Реконструированные яйцеклетки, содержащие ядра бластомеров 16-клетоных зародышей, развивались нормально до стадии бластулы в перевязанном яйцеводе овцы (в агаровом цилиндре), а после освобождения от агара, пересаживали в матку овцы – второго реципиента – ещё на 60 дней. В другом случае донорами служили ядра 8-клетоных зародышей и были получены три живых ягнёнка, фенотип которых соответствовал породе овцы-донора.
В 1989 году Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клетосного эмбриона и ранней бластулы в лишённые ядра неоплодотворенной яйцеклетки овец. В первом случае было получено два живых ягнёнка, фенотип которых соответствовал породе овец – доноров ядер.Во втором случае один полностью сформировавшийся ягнёнок погиб во время родов. Его фенотип также соответствовал породе-донору. Авторы считали, что в ходе дифференцировки эмбрионных клеток происходит инактивация некоторых важных для развития генов и в результате ядра бластулы уже не могут репрограммироваться в цитоплазме яйцеклетки и обеспечить нормальное развитие реконструированного зародыша. Поэтому, по мнению авторов, в качестве доноров ядер лучше использовать 16-клеточные эмбрионы или культивированные in vitro линии эмбриональных клеток, ядра которых обладают тотипотентностью.
Позднее, в 1993-95 гг., группа исследователей под руководством Уилмута получила клон овец – пять идентичных животных, донорами ядер которых была культура эмбриональных клеток. Клеточную культуру получали следующим образом: выделяли микрохирургическим путём эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластулы) и культивировали клетки in vitro в течение многих пассажей (по крайней мере, до 25). Сначала клеточная культура напоминала культуру стволовых дифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после 2-3 пассажей, клетки становились уплотнёнными и морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена как TNT4.
Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находилась на сходных стадиях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на определённой стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в перевязанные яйцеводы овец. Через шесть дней эмбрионы вымывали из яйцеводов промежуточных реципиентов и исследовали под микроскопом. Отбирали те, которые достигали стадии морулы и бластулы и пересаживали их в матку овцы – окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось пять ягнят (самок), из них две погибли вскоре после рождения, третья в возрасте десяти дней, а две оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.