Цитохром с восстанавливается тиолами, аскорбатом, хинолами, и восстановленными цитохромами b и с1, а восстановленный цитохром с окисляется феррицианидом, некоторыми красителями и цитохромом а.
Было показано, что в водных растворах цитохром с способен к полимеризации; удалось получить его димер и очистить так же тример и тетрамер. Вторичная и третичная структура цитохрома с изучается методом
рентгеноструктурного анализа. Цитохром с легко соединяется с липидами, в частности с фосфатидилэтаноламином он образует комплекс, названный липоцитохромом с.
Описание общих принципов различных методов выделения митохондрий.
Митохондрии и после выделения сохраняют свой вид, не смотря на то, что мембраны их несколько повреждаются и контуры сглаживаются. В сущности, в наше время их выделяют тем же самым способом, которым пользовался еще Варбург. Прежде всего ткани гомогенизируют, используя для этого изотонический или гипертонический раствор сахарозы (сахароза способствует сохранности митохондрий, стабилизируя митохондриальную мембрану). Затем методом дифференциального центрифугирования отделяют ядра и неразрушенные клетки, а полученную надосадочную жидкость вновь центрифугируют при более высоких скоростях. Митохондрий оседают при этом на дно, образуя плотный буроватый осадок. Промыв этот осадок несколько раз можно получить довольно чистую митохондриальную фракцию. Таким путем очищенные фракции митохондрий были выделены из самых различных клеток животного и растительного происхождения и даже из некоторых простейших.
В более ранних исследованиях митохондрий, как правило, получали из печени животных, так как её клетки очень легко разрушить, а так же потому, что она богата митохондриальной фракцией. После того, как было обнаружено, что бактериальная протеиназа разрушает клетку, не повреждая митохондрий, был разработан простой и быстрый метод получения мышечных митохондрий. Сахароза способствует сохранности митохондрий, стабилизируя митохондриальную мембрану.
Гомогенизация материала. Методы гомогенизации:
• Разрушение клеток
(гомогенизатор Даунса 5-12 мл + плотно прилегающий пестик). Гипотонический шок + гомогенизатор.
• Метод основанный на кавитации газов
( клеточная суспензия обогащенная газообразным азотом на 15-30 минут выдерживается при давлении до 65 атм., при быстром понижении давления до атмосферного, вследствие выделения азота происходит разрушение клеток. Органеллы остаются интактными).
• Ультразвук.
Состав среды в которой разрушают клетки определяется применяемым методом гомогенизации. Для разрушения тканей используют изоосмотический раствор сахарозы из расчета 100 мл на 10 г сырого веса ткани, при этом нестрашно если раствора сахарозы будет немного больше, особенно при центрифугировании в роторе с большим объемом. Гипотоническая среда способствует разрушению клеток, но, если обработка длится слишком долго, при этом может происходить разрушение клеточных органелл. Остальные параметры среды трудно обобщить и каждый мембранный препарат требует индивидуального подхода.
Разделение субклеточных компонентов.
• Центрифугирование.
Основан на различиях по скорости седиментации (определяется весом, размером и формой частиц). Вещество, используемое для приготовления градиента должно быть легко растворимо в воде, физиологически безвредно и химически инертно; его раствор должен быть невязким, прозрачным в видимой и УФ-областях спектра, должен создавать низкое осмотическое давление. Обычно разделение субклеточных компонентов проводят в градиенте плотности сахарозы. Он удовлетворяет большинству указанных требований, но при высоких концентрациях он весьма вязок. Как правило разделение осуществляется за 3-4 часа или в течение ночи при 80.000 д или выше в роторе с подвесными стаканчиками.
Обработка гомогената из печени крысы 10 мМ фосфатом калия увеличивает скорость седиментации митохондрий, не влияя на осаждение лизосом, что позволяет очищать последние в градиенте плотности перколла.
• Разделение в двухфазной системе, содержащей два полимера.
Полезным и быстрым способом выделения мембран является разделение их в водной двухфазной системе декстран - полиэтиленгликоль (ПЭГ), особенно если отсутствуют необходимые ультрацентрифуги и роторы. Метод, продуктивность которого может быть легко повышена, основан на использовании целого ряда свойств мембран, включая электрический заряд, плотность, массу и гидрофобность. Различие в этих свойствах обуславливает разное распределение компонентов смеси между верхней и нижней фазами и поверхностью раздела. По сродству к верхней фазе компоненты животной клетки располагаются в следующем порядке: эндоплазматический ретикулум / митохондрий / лизосомы / аппарат Гольджи / плазматические мембраны Успех в применении фазовых систем зависит от адекватности выбора их состава. Качество разделения зависит не только от конкретного полимера (пока число их ограничено - в основном используют декстран и ПЭГ), но и от других параметров: молекулярной массы полимера, концентрации солей, рН, химической модификации полимера.
• Электрофорез.
С помощью высоковольтного электрофореза в свободном потоке можно получить препараты субклеточных мембран и органелл высокой степени чистоты. Подлежащую разделению смесь компонентов подают тонкой струйкой в разделяющий буфер, который движется в электрическом поле; мембраны, несущие разный электрический заряд перемещаются в разделяющей ячейке со скоростью, определяемой их зарядом, при этом достигается 100 %-ное разрешение. Это мягкий способ выделения мембран с высоким препаративным выходом. Методику электрофореза в свободном потоке впервые применили для выделения лизосом и митохондрий из печени крысы.
Таблица 1. Ферменты - маркеры митохондрий
| Фракция | Маркерный фермент | |
| Митохондрии | Внутренняя мембрана | Сукцинатдегидрагеназа, Цитохромкидаза, Ротеном-нечувствительная NADH – цитохром с – редуктаза |
| Митохондрии | Наружная мембрана | Моноаминооксидаза, Кинуренин-3-гидроксилаза |
В таблице 1 приведены ферментные маркеры, к которым относятся сравнительно стабильные ферменты, активность которых достаточно высока и ее удобно измерять. Обычно эти измерения проводят как можно быстрее после выделения; образец при этом хранят при 40С и не замораживают. Отмечено, что такой фермент, как цитохром с - редуктаза может оказаться лабильным и терять активность в замороженных препаратах мембран из печени. Для правильной оценки распределения фермента-маркера весьма существенным является пространственное расположение субстрат-связывающего сайта.
Субфракционирование мембран и компонентов матрикса митохондрий.
Митохондрии выделяют из многочисленных источников стандартными методами. Субфракционирование их для получения внутренних и наружных мембран и компонентов матрикса проводят после замораживания - оттаивания препарата и / или обработки ультразвуком стандартного осадка митохондрий, суспендированных в среде, содержащей 1.2 М сахарозы и 2 мМ АТР (10 мг мембранного белка на 1 мл). При этом происходит разрушение митохондрий, а после центрифугирования в ступенчатом градиенте плотность сахарозы наружные мембраны концентрируются в полосе 0,45-1,12 М сахарозы, внутренние мембраны и компоненты матрикса собираются в осадке, под нижним слоем с концентрацией сахарозы 1,2 М, а промежуточная везикулярная фракция - между двумя предыдущими, в полосе 1,12-1,20М.
Маркерами внутренних митохондриальных мембран служат ферменты - переносчики электронов. Наружная митохондриальная мембрана, которая при фрагментации образует везикулы, сходные по плотности и морфологии с везикулами из плазматической мембраны содержит моноаминооксидазу. Описан также метод выделения наружных митохондриальных мембран из печени крыс.
Метод противоточного распределения митохондрий.
Препараты митохондрий, выделенные из печени крысы, были исследованы Эрикссоном с помощью метода противоточного распределения. Митохондрий, входящие в состав каждого из этих препаратов, можно разделить на две основные популяции. Однако элетронно-микроскопическое исследование не позволило обнаружить никаких различий в структуре этих частиц.
Рабочая методика выделения митохондрий из печени крыс.
• Среда выделения: 0,25 М раствор сахарозы, содержащий 0,001 М ЭДТА, рН 7,4
• Сахароза - 0,25 М раствор
• НС1 - 1 н и 0,1 н растворы
• КОН - 1 н и 0,1 н растворы
Все реактивы готовятся на бидистиллированной воде.
Изолированную печень крысы погружают в 30 мл ледяной среды выделения. После 2х - Зх кратного промывания ткань измельчают ножницами на чашке Петри, стоящей на льду. Кашицу вновь помещают в стаканчик со свежей средой выделения и тщательно промывают. После оседания кусочков ткани на дно, жидкость осторожно сливают и промывание повторяют еще дважды. Ткань переносят в гомогенизатор, добавляют 40 мл среды выделения и измельчают в течение 30 - 40 секунд. К гомогенату добавляют 40 мл среды выделения, перемешивают медленно вращающимся пестиком и разливают его в 2 центрифужных стакана. Центрифугируют в течение 10 минут при 0-2 ОС, при 600 д для удаления обломков клеток и ядерной фракции.
Супернатант осторожно сливают и хранят на льду, остатки объединяют и вновь гомогенизируют 20 секунд в 20 мл среды выделения. Гомогенат центрифугируют при 600 д 10 минут, супернатант объединяют с полученным ранее.
Для осаждения митохондрии, объединенный супернатант центрифугируют в двух стаканах при 14000 g в течение 10 минут. Остатки объединяют в одном стакане и тщательно суспендируют с помощью пипетки на 1 мл в небольшом объеме среды выделения (около 0,5 мл). .Маленькими порциями, при осторожном встряхивании добавляют 10 мл среды выделения и осаждают митохондрии (14000 g, 10 минут). Осадок суспендируют в 0,25 М сахарозе, не содержащей ЭДТА, и вновь центрифугируют (14000 g, 10 минут). Супернатант сливают, на полученный осадок митохондрии осторожно наслаивают 0,2 - 0,3 мл 0,25 М сахарозы. Легким встряхиванием смывают верхний рыхлый слой осадка. Процедуру повторяют еще дважды и полученный плотный осадок митохондрии тщательно суспендируют с помощью пипетки в 0,4 - 0,5 мл 0,25 М сахарозы. Густую суспензию митохондрии переносят в пробирку и хранят на льду.