Рубежом в политике насильственной русификации Северо-Западного края, в том числе и в религиозной сфере, стало восстание 1863-64 гг. в Царстве Польском и на белорусско-литовских территориях. Оно затронуло в той или иной мере все пласты населения, не оставило в стороне ни одну из конфессий. Это третье по счету польское восстание преследовало те же цели, что и первые два - восстановление Речи Посполитой в границах 1772 г., но в отличие от прежних оно в большей степени захватило белорусские земли.
Отношение православной части белорусского общества к восстанию было преимущественно негативным. Еще 19 декабря 1861 г. глава литовской православной епархии Семашко, чья роль в развитии "западноруссизма" велика, предвидя грядущие события, направил духовенству секретное предписание. Обратив внимание на то, что "польской партией" возбуждается смута, митрополит Иосиф призвал православное население (и, прежде всего, бывших униатов) не вступать в какие-либо отношения с восставшими и предлагал информировать его обо всех происшествиях. "…Злонамерные люди, - говорилось в документе, сеют неправду и между православными, стараясь совратить их с пути истины, смущают их ложными вестями и внушениями… Нам указывают на Польшу… Но какое дело нам до Польши… Мы родились в России, присягали на верность русскому царю. Нас стращают поляками! Не потому ли, чтобы напомнить нам вековые страдания отцов наших, присоединиться, быть может, доверчиво вместе с Литвою к Польше? Как будто была, или даже могла быть, униатская вера. Как будто уния не была лишь приманкой для отклонения отцов наших от России и от истинно православной восточной церкви? Не была ли эта злосчастная уния орудием тяжких терзаний и гонений, которые испытали наши предки в течении 300 лет?". Обращение литовского митрополита было с пониманием встречено как православными священнослужителями, так и прихожанами.
Иную позицию по отношению к восстанию заняли католики. К этому времени враждебность католического духовенства к российскому правительству не только не ослабла, она еще более усилилась, костел все больше сближался со шляхетской оппозицией. В Белоруссии католическое духовенство формировало в сознании верующих представление о тождестве религиозной и национальной принадлежности: католик - значит поляк. Накануне восстания 1862-1863 гг. костелы стали основным местом его идеологической подготовки, а с началом восстания католическая церковь открыто его поддержала, часть ксендзов приняла в нем активное участие, остальные сочувственно отнеслась к его целям. Оценивая роль, которую сыграло католическое духовенство в восстании 1863 г., генерал-губернатор Северо-Западного края Муравьев отмечал: "Римско-католическое духовенство, разжигая вначале народные страсти и тайно содействуя мятежу, дерзнуло наконец стать открыто во главе восстания; римско-католические монастыри, прикрываясь недоступностью светскому контролю, сделались центром революционной организации и пропаганды". О том, что католическое духовенство было основной идейной силой восстания писали в те годы многие российские историки и публицисты (П. Брянцев, М. Коялович, А. Миловидов и др.).
Роль католического духовенства в восстании была велика: оно поддерживало в народе идеи национальной независимости, возрождения былой славы и могущества Речи Посполитой. Идеологическая подготовка к восстанию в костелах Беларуси велась с начала 60-х гг. Особенно раздражало царские власти звучание в костелах польских патриотических гимнов. Когда началось восстание, многие католические священники открыто в костелах озвучивали манифесты центрального революционного комитета и с амвона призывали крестьян к борьбе против правительственных сил. Делалась попытка использовать униатские настроения, которые, как предполагалось, сохранились у крестьянства. Однако такое обращение к нему К. Калиновского в одном из номеров "Мужицкой правды" осталось безответным.
Если во время первого польского восстания 1794 г. делались попытки привлечь на свою сторону православное духовенство, то теперь о толерантности и стремлениях найти общие интересы не могло идти и речи. И с целью устрашения православных священнослужителей римско-католическое духовенство Польши обратилось в 1861 г. к православному духовенству Польши и Литвы с воззванием: "Не волнуйте сельских жителей, мы вам приказываем, потому, что знаем о ваших злых и тайных умыслах, поступайте с народом благоразумно, внушайте ему любовь к ближнему, потому что мщение поляков за свою веру ужасное".
Восстание ярко выявило противоречия между двумя христианскими конфессиями. Православное и католическое духовенство оказалось в разных, враждебных лагерях. Если католические священнослужители в основном находились на стороне повстанцев, то православные проводили политику официальных властей. Поддержка оказывалась разными способами: помощью правительственным войскам в поисках повстанческих отрядов, распространением среди крестьян слухов, что восстание - это борьба польских панов за возврат крепостного права и т.д. Такие действия, в свою очередь, вызвали ненависть среди повстанцев. Так, в ночь с 22 на 23 мая 1863 г. был убит священник православной церкви в местечке Сураж Гродненской губернии. Всего же от рук повстанцев пострадало, по некоторым сведениям, более 70 православных священнослужителей. Расправы над православными священнослужителями привели к росту антикатолических и антипольских настроений среди православного населения. К этому же времени относятся и первые физические расправы царских властей над католическими священниками. Первой их жертвой стал викарный ксендз Ишора (Лидский повет). Военный суд приговорил его к расстрелу за прочтение Манифеста Национального правительства в январе 1863 г. и призыв населения к восстанию. Приговор привели в действие 22 мая 1863 г.24 мая был расстрелян настоятель Виварского костела (Лидский повет) ксендз Зематский.
В скором времени приверженность католического духовенства повстанцам стала ослабевать. Как только стало ясным, что массовое восстание не удалось, высшее католические сановники обратились к населению с призывом сложить оружие и подчиниться "законному" правительству. Отступническая позиция католического духовенства нанесла большой вред восстанию в Беларуси и Литве, особенно в тех местностях, где население католического вероисповедания составляло значительную часть.
В мае 1863 г. пост генерал-губернатора занимает Муравьев. Под его руководством начинается жестокое подавление мятежного края. Ареной карательных акций стал город Вильно. "Бедных горожан рано будили барабаны и бряцание оружия царских войск, которые вели осужденных к месту наказания (Лукишки). Днем их беспокоило беспрерывное движение полиции, жандармов, вид тех, которых вывозили в Сибирь. Вечером никто спокойно не мог перейти улицу без фонаря. Ночью безустанно кого-то искали или забирали". К 1 января 1865 г. были приговорены к смертной казни 128 человек, из них 68 представителей привилегированного сословия. Более 21 тысячи человек было сослано на каторгу и поселение в Зауралье, Печорский и Омский края. Десятки ксендзов были переселены во внутренние губернии России. Имущество высланных конфисковывалось или подлежало секвестру. Из Беларуси, Литвы и Польши, иногда целыми деревнями, были высланы более 5 тысяч человек в наказание за вооруженное восстание Муравьев обложил всех помещиков-поляков 10-процентным сбором от дохода с имений. За шесть месяцев удалось пополнить казну на 3,5 млн. рублей.
Переход к решительным действиям в западных губерниях импонировал националистическим чувствам российской общественности, разыгравшимся из-за событий в Польше. Муравьев, которого еще вчера многие презирали или недолюбливали, стал героем дня, а его политика - предметом восхищения. "Множество и разнообразие мер, очень разумно задуманных, быстрота, настойчивость и прозорливость в их осуществлении, - писал в письме к Муравьеву Семашко, - все это ваше дело, и никто не может оспаривать у вас имя усмирителя здешнего края".
Репрессии обрушились и на католическую церковь: многие католические священники и монахи были осуждены за участие в восстании, семь ксендзов были расстреляны, 36 сосланы на каторгу, десятки выселены вглубь России, лишены сана или понесли иные наказания. Снова были закрыты 30 монастырей (всего с 30-х гг. по начало XX века был закрыто четыре пятых католических монастырей. Были введены новые ограничения, католические епископы не могли покидать свои епархии без разрешения властей, ксендзы штрафовались за самовольную отлучку в другие приходы и совершение там богослужения, ужесточилась цензура за проповедями, запрещались крестные ходы. После восстания общероссийские законы в отношении католического духовенства были дополнены рядом распоряжений местных властей: о запрещении назначать ксендзов без согласия губернатора на высшие духовные должности (циркуляры от 19 и 23 января 1865 г.); о запрещении заштатным ксендзам ведения богослужения и исполнения христианских обрядов (циркуляры от 13 января, 27 июня 1867г.). Были прерваны отношения с Ватиканом, в 1866 г. был объявлен недействительным конкордат 1847 г., по которому регулировались отношения святого престола со светским государством.
После восстания часть католической шляхты, стремясь продемонстрировать свою лояльность и избавиться от политического и экономического давления властей (так, дворянам-католикам теперь запрещалось приобретать землю), стала переходить в православие. В Литовской епархии, например, в первые годы после восстания в православие перешли ряд помещиков, князья Радивил и Любецкий и другие, много чиновников. За несколько лет после подавления восстания 1863 г. православными стали более 80 тыс. бывших католиков. Митрополит Семашко издал распоряжение, по которому священнослужители должны были вписывать в свои формулярные списки число переведенных ими в православие, для того чтобы можно было судить об их работе. Все это дало результат: в 1897 г. в пяти губерниях проживало уже 5114,7 тыс. православных и 1946,6 тыс. католиков. Последние преобладали только в Виленской губернии.