Разработка методики мониторинга эколого-функционального состояния почвогрунтов (стр. 9 из 18)

При определении активности гидролитических ферментов можно ограничиваться постановкой контроля без субстрата и контроля без почвы, так как известно, что неферментативный гидролиз органических соединений в почве незначителен и за короткий срок инкубации при определении ферментативной активности почвы не может вносить существенной коррективы на результаты опыта. Кроме того, проведение этого контроля довольно хлопотно. Однако предварительно следует убедиться в том, что неферментативный гидролиз субстрата в почве не происходит, особенно в случае содержания в почве значительных количеств различных техногенных химических ингредиентов (загрязнителей), для чего ставят несколько контролей без фермента. При определении активности окислительно-восстановительных ферментов достаточен контроль без фермента, так как он включает в себя контроль без субстрата и контроль без почвы. При расчете ферментативной активности почвы (ФАП) сумму показателей контрольных проб вычитают из показателя опытных вариантов (ПР - продукт реакции), разница соответствует количеству продукта, образовавшегося в результате ферментативного превращения субстрата ФАП = ∑ ПР - ∑ К.б.ф., К.б.с, К.б.п. При пересчёте на единицу веса почвы (на 1 г, 100 г и т.д.) продукт ферментативной реакции характеризует ферментативную активность почвы.

Единицы измерения активности ферментов в почве.Активность фермента выражают в единицах ферментативного действия, что представляет собой изменения, производимые ферментом в субстрате в определённый отрезок времени при строго определённых условиях: концентрации субстрата, рН, температуре и т.д. Как методы определения активности ферментов, так и выражение результатов измерений активности весьма разнообразны. Для отдельных ферментов предложены крайне различные и произвольные единицы. Например, ферментативную активность выражают в физических изменениях субстрата (изменение вязкости, поляризации, оптической плотности), количествах продуктов реакции, количествах превращенной или остаточной части субстрата, ферментных или энергетических единицах и т.д. Отсутствие стандартных единиц измерения активности ферментов не даёт возможности сопоставить результаты даже при применении единых методов.

Наряду с разработкой стандартных условий определения активности ферментов в почве необходимо стандартизировать и способы выражения величин скорости ферментативных реакций. По-видимому, в настоящее время целесообразно сохранить наиболее широко используемую единицу измерения - количество продуктов ферментативного превращения субстрата (мкг, мг, мл, см³, мкМ и др.) на единицу веса почвы за единицу времени при 30 °С. В то же время, в соответствии с рекомендацией Международного биохимического союза по ферментам (Номенклатура ферментов, 1979) за единицу измерения принята стандартная ферментная единица (ФЕ). 1 ФЕ соответствует такому количеству фермента, которое при заданных условиях катализирует превращение 1 мкМ субстрата в 1 мин. В условиях почвенных ферментов это количество может быть рассчитано на единицу веса почвы (например, на 1 г почвы). Однако в почвенно-энзимологических исследованиях в связи с большой гетерогенностью по составу и состоянию ферментов в почве и незначительной их активности в отличие от чистых ферментных препаратов трудно производить перерасчёты на ферментные единицы. В почве определяется не активность конкретной ферментативной молекулы, а ферментативную активность почвы, т.е. проявление некоторой каталитической функции содержащихся в различном состоянии в почвенной массе ферментов (свободных, внеклеточных, внутриклеточных, иммобилизованных, связанных с клеточными фрагментами). В ферментных единицах может быть выражена активность ферментсодержащих препаратов, получаемых экстракцией из почвы. Это фундаментальное направление в почвенной энзимологии в настоящее время получает своё развитие.[25]

4.2 Методы определения активности ферментов различных классов

По типу катализируемых реакций все известные ферменты разделены на шесть классов:

1. Оксидоредуктазы, катализирующие окислительно-восстановительные реакции.

2. Гидролазы, катализирующие реакции гидролитического расщепления внутримолекулярных связей в различных соединениях.

3. Трансферазы, катализирующие реакции межмолекулярного или внутримолекулярного переноса химической группы и остатков с одновременным переносом энергии, заключенной в химических связях.

4. Лигазы (синтетазы), катализирующие реакции соединения двуxмолекул, сопряжённые с расщеплением фирофосфатных связей АТФ или другого аналогичного трифосфата.

5. Лиазы, катализирующие реакции негидролитического отщепления или присоединения различных химических групп органических соединений по двойным связям.

6, Изомеразы, катализирующие реакции превращения органических соединений в их изомеры.

В почве широко распространены и довольно подробно изучены оксидоредуктазы и гидролазы, имеющие очень важное значение в почвенной биодинамике.[25]

4.2.1 Каталаза

(Н₂О₂ : Н₂О₂ –оксидоредуктаза)

Каталаза катализирует реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и молекулярного кислорода:

Н₂О₂ + Н₂О₂ О₂ + Н₂О.

Перекись водорода образуется в процессе дыхания живых организмов и в результате различных биохимических реакций окисления органических веществ. Токсичность перекиси водорода определяется его высокой реакционной способностью, которую проявляет синглетный кислород, *О₂ . Его высокая реакционная способность приводит к неконтролируемым реакциям окисления. Роль каталазы заключается в том, что она разрушает ядовитую для организмов перекись водорода.

Каталаза широко распространена в клетках живых организмов, в том числе микроорганизмов и растений. Высокую каталазную активность проявляют также почвы.

Методы определения каталазной активности почвы основаны на измерении скорости распада перекиси водорода при взаимодействииее с почвой по объему выделяющегося кислорода (газометрические методы) или по количеству неразложенной перекиси, которое определяют перманганатометрическим титрованием или колориметрическим методом с образованием окрашенных комплексов.

Исследованиями Е.В. Даденко и К.Ш. Казеева установлено, что при хранении образцов активность каталазы из всех ферментов снижается в наибольшей степени, поэтому ее определение необходимо проводить в первую неделю после отбора образцов.

Метод А.Ш. Галстяна [1978]

Ход анализа. Для определения активности каталазы используют прибор из двух соединенных резиновым шлангом бюреток, которые заполняют водой и уравновешивают ее уровень. Поддерживание определенного уровня воды в бюретках свидетельствует о достижении температурного равновесия в приборе. Навеску (1 г) почвы вносят в одно из отделений сдвоенной колбы. В другое отделение колбы приливают 5 мл 3-процентного раствора перекиси водорода. Колбу плотно закрывают каучуковой пробкой со стеклянной трубкой, которая соединена с измерительной бюреткой с помощью резинового шланга.

Опыт проводят при температуре 20 °С, так как при другой температуре скорость реакции будет отличаться, что исказит результаты. В принципе важна температура не воздуха, а перекиси, именно она должна быть 20 ⁰С. Если температура воздуха значительно выше 20 ⁰С (летом), рекомендуется проводить анализ в подвале или в другом прохладном помещении. Рекомендованное в таких случаях применение водяной бани с температурой 20°С вряд ли эффективно.

Начало опыта отмечают по секундомеру или песочным часам в тот момент, когда перекись смешивается с почвой, и содержимое сосуда встряхивают. Взбалтывание смеси производят в течение всего опыта, стараясь не касаться колбы руками, держа ее за пробку. Выделяющийся кислород вытесняет из бюретки воду, уровень которой отмечают через 1 и 2 мин. Рекомендация определять количество кислорода через каждую минуту в течение 3 мин ввиду прямолинейности реакции разложения перекиси лишь увеличивает затраты времени на анализ.

Данная методика позволяет одному исследователю за день проанализировать активность каталазы более чем 100 образцов. Удобно проводить анализ вдвоем, используя 5-6 сосудов. При этом один человек непосредственно занимается анализом и следит за уровнем бюретки, а второй следит за временем, записывает данные и моет сосуды.

Контролем служит стерилизованная сухим жаром (180°С) почва. Некоторые почвы, соединения и минералы обладают высокой активностью неорганического катализа разложения перекиси даже после стерилизации - до 30-50 % от общей активности.

Активность каталазы выражают в миллилитрах О₂, выделяющегося за 1 мин из 1 г почвы.

Реактивы: 3-процентный раствор Н₂О₂ . Концентрацию пергидроля обязательно периодически проверяют, рабочий раствор готовят непосредственно перед анализом. Для установления концентрации пергидроля на аналитических весах в мерной колбе емкостью 100 мл взвешивают 1 г Н₂О₂, объем доводят до метки и взбалтывают. Помещают 20 мл полученного раствора в конические колбы на 250 мл (3 повторности), добавляют 50 мл дистиллированной воды и 2 мл 20-процентной Н₂SO₄. Затем титруют 0,1 н. раствором КМnО₄. 1 мл раствора КМnО₄ соответствует 0,0017008 г Н₂О₂. После установления концентрации пергидроля готовят 3-процентный раствор разбавлением дистиллированной водой. Титровальный раствор КМnО₄ готовят из фиксанала и выдерживают несколько дней для установления титра.

4.2.2 Дегидрогеназы