Разработка методики мониторинга эколого-функционального состояния почвогрунтов (стр. 8 из 18)
Существенным требованием к субстратам является их хорошая растворимость. Нерастворимые или слаборастворимые субстраты трудно вступают во взаимодействие с ферментами.
Реакция среды и буферные растворы. Скорость ферментативных реакций зависит от значений рН среды. Максимальная активность ферментов проявляется лишь в узком интервале значений рН, которые называют оптимум рН действия данного фермента. Как уменьшение, так и увеличение рН приводит к снижению активности ферментов (рис. 3). Поддержание оптимального и постоянного значений рН в реакционной среде на протяжении опыта при определении ферментативной активности является одним из важных методологических условий. Опытным путем устанавливается значение оптимума рН ферментов. При этом следует учесть, что почвы с различными значениями рН неодинаково влияют на сдвиг рН буферного раствора. Это зависит от буферности самой почвы, существенные сдвиги могут быть в малобуферных кислых и щелочных почвах. При определении оптимумов рН ферментов почвы после прибавления реакционной смеси к почве значение рН суспензии доводится до соответствующей величины значения буферного раствора потенциометрическим титрованием.
При определении ферментативной активности для обеспечения заданной рН используют буферные растворы с величиной рН, соответствующей оптимуму действия данного фермента. Предлагается также определять ферментативную активность почвы при рН почвы, так как почва - сама буферная система. Однако это зависит от цели определения активности фермента. При решении прикладных задач по ферментативной диагностике почв предпочтительно определять активность почвы при почвенном значении рН, а при исследовании чисто фундаментальных почвенно – энзимологических вопросов рН среды должен быть оптимальным для данного фермента.
Рис.3. Влияние рН среды на активность ферментов
Важное значение имеет катионно – анионный состав буферного раствора: различные катионы и анионы оказывают неодинаковое влияние на отдельные ферменты и на почвы. Так, фосфат-ионы будут ингибировать фосфатазу, если используется фосфатный буфер при определении фосфатазной активности почвы; ионы аммония могут ингибировать уреазу, если использовать аммиачный буферный раствор. Лимонно-кислые ионы буферных растворов будут связываться с ионами железа, если их много в почве. Другим важным требованием к буферным растворам является, чтобы они не растворяли и экстрагировали из почвы окрашенное органическое вещество, что будет мешать при последующем спектрофотометрическом и титрометрическом анализе продуктов ферментативной реакции. Поэтому экспериментально подбирают необходимый состав буферного раствора для каждого вида фермента и с учетом свойств почвы.
Температура инкубации. Скорость ферментативных реакций зависит от температуры. По мере повышения температуры до определенного значения скорость реакции возрастает, при высоких температурах ферменты денатурируют и теряют свою активность. Низкие температуры снижают ферментативную активность. Максимальную активность ферментов в почве обнаруживают в пределах температур от 45 до 600С (рис.4). Однако активность почвенных ферментов не определяют при оптимальных значениях температуры, так как они сильно отличаются от естественной температуры почвы за вегетативный период. Кроме того, в результате относительной деятельности сроков инкубации (от нескольких часов до нескольких суток) при таких температурных условиях может происходить некоторая термическая инактивация ферментов и разложение некоторых субстратов. Определение активности почвенных ферментов обычно производят при температуре 30 – 500С. Однако, согласно рекомендациям Международного союза по номенклатуре и классификации ферментов, необходимо придерживаться стандартной температуры 30 0С.
Рис.4. Влияние температуры на активность нуклеазы в почве (выщелоченный чернозем)
Продолжительность инкубации. Ферментативную активность почвы необходимо определять при начальной скорости реакции и сохранять ее постоянной в течение всего времени экспозиции (рис.5). Скорость ферментативной реакции во времени может падать в результате следующих причин:
1. уменьшения концентрации субстрата ниже насыщающей концентрации, поскольку он расходуется в процессе реакции, а также может адсорбироваться почвой;
2. частичного разрушения самих ферментов во время реакции;
3. влияния образующихся продуктов реакции, особенно на ферменты при длительных сроках.
Рис.5. Изменение скорости фосфатазной реакции в почве (дерново-подзолистая почва)
При этом возможны два типа влияния: специфическое торможение активности ферментов продуктами реакции и обратимость ферментативных реакций, так как по закону действующих масс скорость обратимых реакций пропорциональна произведению концентраций реагирующих веществ.
В связи с относительной низкой активностью фермента в почве время компостирования почв с субстратом продолжительное – от нескольких часов до нескольких суток. Необходимо время инкубации сократить до минимума, чтобы исключить отрицательный эффект вышеуказанных факторов и возможность роста колоний некоторых видов микроорганизмов.
Перемешивание реакционной смеси в процессе инкубации. Ферменты в почве находятся преимущественно в адсорбированном или ином связанном состоянии почвенными коллоидами. Постоянный приток субстрата к ферментам и удаление продуктов реакции из зоны действия ферментов достигаются периодическим взбалтыванием реакционной смеси в процессе инкубации. Имеет значение частота встряхивания, которую устанавливают опытным путем при определении активности каждого фермента. Необходимо поддерживать одинаковую периодичность и энергичность встряхивания в процессе инкубации реакционной смеси.
Количественная экстракция продуктов реакции. Одним из важных требований к методам почвенной энзимологии является полная экстракция из почвы продуктов ферментативной реакции, по количеству которых измеряют активность фермента. В качестве экстрагентов используют соответствующие буферные растворы, различные растворители. Измеряют количество экстрагированного компонента продуктов ферментативной реакции, который не адсорбируется или минимально адсорбируется почвой. Например, при определении фосфатазной активности лучше измерять количество органической части продуктов гидролиза фенилфосфата или фенолфталеинфосфата, используемых в качестве субстрата – фенола и фенолфталеина, так как ортофосфат активно связывается почвой и по ортофосфату можно получить заниженные показатели ативности.
Контрольные пробы.В почве всегда присутствуют вещества, аналогичные продуктам распада большинства органических веществ, применяемых в качестве субстратов при почвенно-энзимологических исследованиях (глюкоза, аминокислоты, фосфор, аммоний и др.). Поэтому для корректировки результатов определения активности ферментов ставят следующие контрольные опыты.
1. Контроль на неферментативное превращение субстрата (контроль без фермента - К.б.ф.). Строго обязателен, особенно при определении активности окислительно-восстановительных ферментов, потому что в почве всегда присутствуют переменно-валентные катионы (Сu, Мn, Мо и др.), способные переносить электроны и осуществлять окислительно-восстановительные превращения. Обычно неферментативный гидролитический распад субстратов в почве незначителен или отсутствует. Для инактивации ферментов параллельные навески почв в реакционных сосудах стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2-3 ч или автоклавируют при 2 атм. в течение 1 ч несколько раз. При этих условиях ферменты, иммобилизованные в почве, полностью инактивируются. Однако такие контроли нецелесообразны в тех случаях, когда продукты ферментативных реакций определяют фотометрическим методом или титрованием. Нагревание почвы при высокой температуре сильно изменяет её органическое вещество, оно становится растворимым и окрашивает фильтраты. Вместо жёсткой термической инактивации ферментов часто используют специфические химические ингибиторы: соли тяжёлых металлов, цианиды и др. В стерилизованную сухим жаром или обработанную ингибитором почву вносят антисептик, буферный раствор, субстрат и дальше проводят те же самые операции, что и с опытными пробами. В случае применения ингибитора фермента после инкубации в опытные сосуды добавляют такое же количество ингибитора. Могут быть использованы и другие эффективные способы инактивации ферментов при минимальном воздействии на почвенные свойства.
2. Контроль на почвенные вещества, учитываемые вместе с продуктами ферментативной реакции (контроль без субстрата -К.б.с). Нестерильную почву обрабатывают толуолом, вносят буферный раствор и соответствующий объём воды вместо субстрата. Дальнейшие операции аналогичны опытным процедурам.
3. Контроль на чистоту реактивов и субстрата и на спонтанный распад субстрата (контроль без почвы К.б.п) В реакционные сосуды наливают указанные в соответствующей методике количества субстрата, буфера и антисептика и эту контрольную смесь обрабатывают как опытную. Достаточно поставить один контроль для данной серии реактивов и субстрата.