Разработка методики мониторинга эколого-функционального состояния почвогрунтов (стр. 10 из 18)

(субстрат : НАД (Ф)-оксидоредуктазы).

Дегидрогеназы катализируют окислительно-восстановительныереакции путем дегидрирования органических веществ. Они проходят по следующей схеме:

АН₂ + В А+ ВН₂

В почве субстратом дегидрирования могут быть неспецифические органические соединения (углеводы, аминокислоты, спирты, жиры, фенолы и т.д.) и специфические (гумусовые вещества). Дегидрогеназы в окислительно-восстановительных реакциях функционируют как переносчики водорода и разделяются на две группы: 1) аэробные, передающие мобилизированный водород кислороду воздуха; 2) анаэробные, которые передают водород другим акцепторам, ферментам.

Основным методом обнаружения действия дегидрогеназ является восстановление индикаторов с низким редокс-потенциалом типа метиленовой сини.

Для определения активности дегидрогеназ почвы в качестве водорода применяют бесцветные соли тетразолия (2,3,5-трифенилтетразолий хлористый - ТТХ), которые восстанавливаются в красные соединения формазанов (трифенилформазан - ТФФ).

Ход анализа. Навеску (1 г) подготовленной почвы аккуратно через воронку помещают на дно пробирки емкостью 12-20 мл и тщательно перемешивают. Прибавляют 1 мл 0,1 М раствора субстрата дегидрирования (глюкоза) и 1 мл свежеприготовленного 1-процентного раствора ТТХ. Пробирки помещают в анаэростат или вакуумный эксикатор. Определение проводят в анаэробных условиях, для чего воздух эвакуируют при разрежении 10-12 мм рт. ст. в течение 2-3 мин и ставят в термостат на 24 ч при 30 °С. При инкубировании почвы с субстратами толуол в качестве антисептика не прибавляют, так как; он сильно ингибирует действие дегидрогеназ. Контролем служат стерилизованная почва (при 180°С в течение 3 ч) и субстраты без почвы. После инкубации в колбы добавляют 10 мл этилового спирта или ацетона, встряхивают 5 мин. Полученный окрашенный раствор ТФФ фильтруют и колориметрируют. При очень интенсивной окраске раствор разбавляют спиртом (ацетоном) в 2-3 раза. Используют 10-мм кюветы и светофильтр с длиной волны 500-600 им. Количество формазана в мг рассчитывают по стандартной кривой (0,1 мг в 1 мл). Активность дегидрогеназ выражают в мг ТТФ на 10 г почвы за 24 ч. Ошибка определения до 8 %.

Реактивы:

1) 1-процентный раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого;

2) 0,1 М раствор глюкозы (18 г глюкозы растворяют в 1000 мл дистиллированной воды);

3) этиловый спирт или ацетон;

4) трифенилформазан для стандартной шкалы. Для составления калибровочной кривой готовят ряд растворов в этиловом спирте, ацетоне или толуоле с концентрацией формазана (от 0,01 до 0,1 мг формазана в 1 мл) и фотоколориметрируют, как описано выше.

При отсутствии формазана его получают восстановлением ТТХ гидросульфитом натрия (сульфитом аммония, порошком цинка в присутствии глюкозы). Исходная концентрация раствора ТТХ 1 мг/мл. К 2 мл исходного раствора ТТХ добавляют на кончике ланцета кристаллический гидросульфит натрия. Выпавший осадок формазана извлекают 10 мл толуола. В таком объеме толуола содержится 2 мг формазана (0,2 мг/мл). Дальнейшим разведением готовят рабочие растворы для шкалы.

4.2.3 Инвертаза

(β-фруктофуранозидаза, сахараза)

Инвертаза является карбогидразой, она действует на β-фруктофуранозидазную связь в сахарозе, раффинозе, генцианозе и др. Наиболее активно этот фермент гидролизует сахарозу с образованием редуцирующих сахаров - глюкозы и фруктозы:

инвертаза

С₁₂Н₂₂О₁₁ + Н₂О С₆Н₁₂О₆ + С₆Н₁₂О₆

сахароза глюкоза фруктоза

Инвертаза широко распространена в природе и встречается почти во всех типах почв. Очень высокая активность инвертазы обнаружена в горно-луговых почвах. Активность инвертазы четко коррелирует с содержанием гумуса и почвенным плодородием. Рекомендуется при изучении влияния удобрений для оценки их эффективности. Методы определения активности инвертазы почв основаны на количественном учете восстанавливающих сахаров по Бертрану и по изменению оптических свойств раствора сахарозы до и после воздействия фермента. Первый способ может быть применен при изучении фермента с очень широкой амплитудой активности и концентрации субстрата. Поляриметрический и фотоколориметрический способы более требовательны к концентрации сахаров и неприемлемы для почв с высоким содержанием органического вещества, где получаются, окрашенные растворы; поэтому эти методы ограниченно применяются в почвенных исследованиях.

Модифицированный колориметрический метод Ф.Х. Хазиева

Ход анализа. Навески (1 г) подготовленной почвы помещают в колбы емкостью 50 мл, добавляют 5 мл 3-процентного свежеприготовленного раствора сахарозы на фосфатном буфере (рН 4,9) и каплю-две толуола. При биодиагностике почв активность инвертазы определяют без добавления буфера - при рН почвы. Колбы закрывают корковыми пробками, осторожно встряхивают и помещают в термостат при 30 ⁰С на 24 ч. Контролем служат субстраты без почвы и почва, стерилизованная сухим жаром, при 180 ⁰С в течение 3 ч. В течение инкубации колбы периодически встряхивают. После инкубации в колбы добавляют 25 мл дистиллированной воды, взбалтывают и фильтруют. В случае высокой активности инвертазы (особенно в горно-луговых и торфянистых почвах с высоким содержанием гумуса) количество добавляемой воды увеличивают до 50-100 мл. В случае низкой активности количество дистиллята уменьшают до 5-10 мл. Разведение учитывают при расчетах активности фермента.

Берут пипеткой 6 мл фильтрата в пробирку объемом 15-20 мл. Добавляют пипеткой 6 мл реактива Феллинга, перемешивают. Пробирку с ярко-синим раствором нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. При нагревании часть меди реактива Феллинга восстанавливается и выпадает в осадок красного цвета, при этом раствор осветляется. Далее пробирки охлаждают, содержимое центрифугируют 1-3 мин при 1500-3000 об./мин. Колориметрируют при длине волны 630 нм в кюветах шириной 1 см..

Окрашенный раствор лучше колориметрировать на фотоэлектроколоримотре КФК-3 с непрерывной шкалой, так как использование КФК-2 или .подобных ему приборов с ограниченной шкалой дает неточные результаты, ввиду того что большинство значений ложится в левой недробной половине шкалы.

Количество глюкозы (мг/мл) определяют по калибровочной кривой. Полученные данные умножают на 30 (общий объем раствора). Активность инвертазы выражают в миллиграммах глюкозы на 1 г почвы за 24 ч

Реактивы:

1) свежеприготовленный 3-процентный раствор сахарозы (для хранения раствора в течение нескольких дней добавляют несколько капель толуола);

2) толуол;

3) реактив Феллинга (готовый реактив не хранится и готовится смешиванием двух растворов перед анализом: раствор-1 - 100 г сегнетовой соли (калий-натрий виннокислый) растворяют в дистиллированной воде, прибавляют 75 г КОН или NaOHи доводят объем до 500 мл; раствор-2 - 20 г CuSO₄ растворяют в дистиллированной воде и доводят до 500 мл);

4) стандартный раствор глюкозы. Исходный раствор: 6 мг глюкозы в 1 мл дистиллированной воды. Рабочие растворы готовят, доводя 1, 2, 5, 10, 15, 20 мл исходного раствора (соответственно 0,06, 0,12, 0,30, 0,6, 0,9 и 1,2 мг глюкозы в 1 мл раствора) дистиллятом в мерных колбах до 100 мл. Далее к 6 мл растворов добавляют реактив Феллинга и дальше действуют по описанной выше методике.

4.2.4 Протеазы (пептид-гидролазы)

Протеолитичеекне ферменты катализируют гидролитическое расщепление белковых веществ до пептидов и гидролиз этих продуктов до аминокислот.

Протеазы делят на две группы: протеиназы и пептидазы. Первые из них расщепляют настоящие белки, а вторые катализируют распад полипептидов и дипептидов до аминокислот. Однако такое деление довольно условно.

При определении активности протеаз в почве в качестве субстрата обычно применяют казеин, желатину и некоторые пептиды. Активность протеаз учитывают по количеству аминокислот или других кислоторастворимых продуктов, освобождающихся при распаде белковых субстратов в почве, либо по изменению физических свойств субстрата, например но уменьшению вязкости.

Колориметрические методы основаны на учете количества аминокислот, образующихся при протеолизе внесенных в почву белков, путем связывания их в окрашенные комплексы.

Метод А.Ш. Галстяна [1978]

Ход анализа. 1 г почвы помещают в стеклянную колбу емкостью 50 мл, прибавляют 5 мл 1-процентного раствора желатины или казеина, приготовленного на фосфатном буфере (рН 7,4), и 0,2 мл толуола. Колбу тщательно встряхивают, закрывают корковой пробкой и ставят в термостат на 24 ч при температуре 30 ⁰С, периодически встряхивают. После инкубации добавляют 5 мл воды и содержимое колбы фильтруют. Из фильтрата берут 5 мл раствора в пробирку, прибавляют 0,5 мл0,1 н. серной кислоты и 3 мл 20-процентного сернокислого натрия для осаждения белков. Затем снова фильтруют в пробирку и добавляют 1 мл 2-процентного раствора нингидрина. Смесь тщательно взбалтывают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Полученный окрашенный раствор из пробирки переливают в мерную колбу объемом 50 мл, объем доводят дистиллированной водой до метки и проводят фотоколориметрирование, используя зеленый светофильтр (длина волны 500-560 нм). Контрольные пробы ставят со стерилизованной сухим жаром почвой и субстратом без почвы. Количество аминокислот в переводе на глицин находят по калибровочной шкале, составленной на чистый глицин.

Активность протеазы выражают в миллиграммах глицина на 1 г почвы за 24 ч.

Реактивы:

1) 1-процентный раствор желатины или казеина в фосфатном буфере (рН 7,4) - при биодиагностике используют водный раствор;

2) толуол;

3) фосфатный буфер (рН 7,4);