Микробная биодеградация ксенобиотиков и токсикантов (стр. 4 из 4)

3.2. Изменение генов

Объединение разных метаболических путей в одном микроорганизме с помощью конъюгации - это лишь один из способов создания бактерий с новыми свойствами. Расширить их катаболические возможности можно и другим путем, модифицируя гены, кодирующие ферменты того или иного метаболического пути. Осуществимость этого подхода проверяли на примере плазмиды pWWO, 12 генов которой кодируют мета-расщепление толуола и ксилола. Обладающие этой плазмидой псевдомонады могут использовать в качестве источника углерода алкилбензоаты [5].

Детальный биохимический и генетический анализ показал, что несущие pWWO-плазмиду бактерии могут расщеплять 4-этилбензоат только до 4-этилкатсхола, который инактивирует один из основных ферментов данного метаболического пути, катехол-2,3-диоксигеназу, являющуюся продуктом гена xylE, и поэтому не разрушается и накапливается в среде. Кроме того, 4-этилбензоат, в отличие от остальных алкилбензоатов, не активирует XylS-белок; поэтому, если он является единственным субстратом, хуl-оперон не транскрибируется. Для усовершенствования природной системы летиорасщепления алкилбензоатов необходимо решить две основные задачи:

1) предотвратить инактивацию катеход-2,3-диоксигеназы 4-этил-бензоатом;

2) индуцировать транскрипцию генов хуl -оперона в том случае, если единственным субстратом является 4-этилбензоат[5].

Для решения второй задачи был проведен поиск мутантной плазмиды. Для этого в плазмиду, несущую ген устойчивости к ампициллину, встроили ген устойчивости к тетрациклину, находящийся под контролем Р_т-промотора. В другую плазмиду, несущую ген устойчивости к канамицину, встроили ген xylS. Полученными конструкциями трансформировали E. coli, отобрали клетки, содержащие обе плазмиды, по признаку устойчивости к ампициллину и канамицину (рис. 8, А), обработали их мутагеном этилметансульфонатом и вырастили на среде, содержащей тетрациклин и 4-этилбензоат. Растущие на этой среде клетки содержат мутантный ген xylS и продуцируют измененный XylS-белок (S*), который способен взаимодействовать с 4-этилбензоатом и активировать транскрипцию гена устойчивости к тетрациклину. Чтобы решить проблему инактивации катехол - 2,3 -диоксигеназы, мутантный ген xylS встроили в плазмиду с широким кругом хозяев, несущую ген устойчивости к канамицину, и ввели ее в клетки P. putida, содержащие плазмиду pWWO (рис. 8, Б). Трансформированные клетки высеяли с высокой плотностью на чашки с минимальной средой, содержащей 4-этилбензоат в качестве единственного источника углерода, канамицин для отбора клеток с плазмидой и этилметансульфонат. Клетки, растущие на этой среде, вырабатывают измененную катехол-2,3-диоксигеназу, которая не ингибируется 4-этил-катехолом. Дополнительный анализ подтвердил, что в гене катехол-2,3-диоксигеназы pWWO действительно произошла мутация и что два мутантных гена обеспечивают расщепление 4-этилбензоата [5].

Оба модифицированных гена участвуют в процессе деградации всех субстратов данного метаболического пути. Поэтому стратегия, использованная для повышения эффективности расщепления 4-этилбензоата, применима и в случае других соединений. Таким образом, проведенная работа показывает, что вполне реально усовершенствование того или иного катаболического пути с помощью технологии рекомбинантных ДНК, традиционного мутагенеза и соответствующих методов отбора [5].

Рис.8, А. Создание системы синтеза белка XylS-белка, активируемого 4-этилбензоатом

Рис.8, Б. Создание системы синтеза модифицированной катехол-2,3-дикосигеназы, которая не ингибируется 4-этилкатехолом

4.МЕХАНИЗМЫ УСКОРЕНИЯ БИОДЕГРАДАЦИИ ПОЛЛЮТАНТОВ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ

Биодеградация персистентных поллютантов в природе может длиться десятки лет, вызывая нарушение функционирования биоценозов. Бурное развитие экологической биотехнологии как науки и формирование рынка экологических биотехнологий в развитых странах вселяют некоторый оптимизм относительно решения в будущем проблемы глобального загрязнения окружающей среды [6].

Поскольку биодеградация загрязнителей осуществляется, в основном, в результате жизнедеятельности бактерий и грибов, пополнение знаний о функционировании этих организмов позволяет разрабатывать новые подходы к осуществлению ускоренной и более полной деградации ксенобиотиков [6].

Уже традиционными стали технологии биоремедиации загрязненной почвы, основанные на стимуляции естественной деструктивной микрофлоры или интродукции высокоактивных штаммов микроорганизмов. Однако среди ученых не утихают споры по поводу экологической и коммерческой оправданности внесения чужеродных организмов в сформировавшиеся природные ценозы. Не вызывает сомнения необоснованность рекомендаций по повсеместному использованию нефтеокисляющих биопрепаратов. Более экологичными можно считать способы стимуляции аборигенных микроорганизмов in situ. Проведенные нами исследования и анализ многочисленных публикаций в ведущих научных изданиях показывают сопоставимость эффективности названных приемов. Что же касается стоимости, стимуляция имеет неоспоримые преимущества, хотя и в этом случае требуется строгий токсикологический контроль за состоянием ремедиируемого участка [6]..

Последнее десятилетие характеризуется всплеском развития фиторемедиации - технологии, основанной на использовании растений. Известно, что растительная ризосфера за счет ее насыщенности ассоциативными и симбиотическими микроорганизмами является зоной повышенной биохимической активности, что и служит причиной ускорения процессов биодеградации поллютантов в почве под растениями. Вместе с тем, фиторемедиация является эффективной, экономически выгодной и эстетически привлекательной технологией, наиболее принимаемой обществом. Однако по конечному результату она сопоставима с другими экологическими биотехнологиями [6].

В научных публикациях последних лет появилась новая зеленая технология - трансгенная ремедиация, которую можно считать самым эффективным приемом очистки почвы на сегодняшний день. Использование трансгенных растений позволяет повысить деградацию поллютантов в сотни раз. Однако представляется маловероятным широкое использование этой технологии в обозримом будущем [6].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биодеградация – это процесс разрушения микроорганизмами веществ, загрязняющих окружающую среду [5].

Микробная деградация играет существенную роль в процессах детоксикации устойчивых поллютантов, загрязняющих среду в результате деятельности человека. Особенно важное значение процессы микробной биоконверсии имеют при деградации галогенированных ксенобиотиков, для токсикации которых термальные и физико-химические методы непригодны, так как приводят к образованию более токсичных соединений типа диоксинов и бензофуранов [7].

Многие бактерии рода Pseudomonas несут плазмиды, кодирующие ферменты, которые катализируют расщепление ароматических и галогенсодержащих органических соединений. В большинстве случаев одна плазмида содержит гены ферментов одного специфичного катаболического пути. Объединяя плазмиды разных штаммов в одном хозяине, можно создать организм, способный к деградации нескольких соединений. Кроме того, с помощью генетических манипуляций можно расширить спектр субстратов, разрушаемых с помощью определенного ферментативного пути [5].

Полученные результаты по изучению особенностей деградации ксенобиотиков, разработка способов интенсификации разложения поллютантов, возможность на основании полученных данных по пространственной структуре молекул методом направленного мутагенеза получать ферменты с заданной/измененной субстратной специфичностью позволяют создать высокоэффективные бактериальные или ферментные препараты для очистки территорий, а также оптимизировать процессы биоремедиации почв и очистки промышленных стоков, содержащих галогенированные поллютанты [7].

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Биодеградация серусодержащего полимера в процессе очистки сточных вод химических производств / Е.В.Перушкина [и др.] // Химическая промышленность сегодня. – 2008. - № 7. – с. 42-49. ISSN 0023 110Х

2. Волова, Т.Г. Биотехнология / Т.Г. Волова. – Новосибирск : Издательство Сибирского отделения РАН, 1999. – 252 с. ISBN 5-7692-0204-1

3. Саловарова, В.П. Введение в биохимическую экологию : учеб.пособие / В.П. Саловарова, А.А. Приставка, О.А. Берсенева. – Иркутск : Издательство Иркутского государственного университета, 2007. – 159 с. ISBN 978-5-9624-0224-6

4. Карасевич, Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения / Ю.Н. Карасевич. – М. : наука, 2002. – 144 с. ISBN 5-76802-386-8

5. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение : [пер.с англ.] / Б. Глик, Дж. Пастернак. – М. : Мир, 2002. – 589 с., ил. ISBN 5-03-003328-9

6. Механизмы ускорения биодеградации поллютантов в окружающей среде [Текст] / О.В. Турковская // Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера» : тезисы. – М. : ИНМИ РАН. – 2007 г. – Библиограф. : с. 130.

7. Физико-биохимические основы бактериальной деградации ксенобиотиков [Текст] / Л.А. Головлева [и др.] // Международная научная конференция «Микроорганизмы и биосфера» : тезисы. – М. : ИНМИ РАН. – 2007 г. – Библиограф. : с. 31.