Микробная биодеградация ксенобиотиков и токсикантов (стр. 3 из 4)

Бактерии, разрушающие негалогенированные ароматические соединения, как правило, превращают их в катехол (рис. 2) или протокатехоат (рис. 3), а затем, в ходе нескольких реакций окислительного расщепления, - в ацетил-СоА и сукцинат (рис. 4) или пируват и ацетальдегид (рис. 5). Эти последние соединения метаболизируются практически всеми микроорганизмами. Галогенированные ароматические соединения, основные компоненты большинства пестицидов и гербицидов, с помощью тех же ферментов разрушаются до катехола, протокатехоата, гидрохинона или их галогенированных производных, причем скорость их деградации обратно пропорциональна числу атомов галогена в исходном соединении. Дегалогенирование (отщепление замещающего атома галогена от органической молекулы), необходимое для детоксикации соединения, часто осуществляется в ходе неспецифической диоксигеназной реакции, путем замещения галогена в бензольном кольце на гидроксильную группу. Эта реакция может происходить как в ходе биодеградации исходного галогенированного соединения, так и потом [5].

Рис. 2. Пути ферментативного превращения ароматических соединений в катехол бактериями, разрушающими ксенобиотики

Рис.3. Пути ферментативного превращения ароматических соединений в протокатехоат бактериями, разрушающими ксенобиотики

Рис. 4. Путь орто-расщепления при ферментативном превращении катехола и протокатеохата в ацетил-СоА и сукцинат

Рис.5. Путь мета- расщепления при ферментативном превращении катехола и протокатеохата в пуриват и ацетальдегид

Биологические методы также применимы для очистки природной среды от нефтяных загрязнений, представляющих собой как сточные воды нефтяной промышленности, так и непосредственное загрязнение в результате разлива нефти. Сточные воды нефтяной промышленности очищают биологическими методами после удаления большей части смеси различных углеводородов физическими методами. Для этого применяют аэрируемые системы биоочистки с активным илом, содержащим адаптированное к компонентам нефти сообщество. Скорость деградации зависит от качественного состава и концентрации углеводородов, а также температуры и степени аэрации среды. Наиболее эффективно биодеградация осуществляется, когда нефть эмульгирована в воде. Особую проблему представляют выбросы и аварийные разливы нефти на поверхность почвы. Это приводит не только к загрязнению пахотных земель, но также и источников питьевой воды. В почве содержится много микробных видов, способных деградировать углеводороды, но их активность часто низка, в том числе и в результате дефицита отдельных биогенных элементов. В таких случаях эффективным является внесение в почву так называемых «олеофильных удобрений», в состав которых входят соединения азота, фосфаты и другие минеральные элементы, концентрации которых в почве достаточно низки и лимитируют рост микроорганизмов. После внесения этих соединений в почву концентрация микроорганизмов-деструкторов существенно возрастает, и возрастает скорость деградации нефти [2].

С помощью генетического конструирования создан «супермикроб», способный утилизировать большинство основных углеводородов нефти (рис. 6). Многие природные штаммы Pseudomonas putida несут катаболические плазмиды, каждая из которых кодирует фермент для расщепления одного класса углеводородов - плазмида ОСТ обуславливает расщепление октана, гексана, декана; XYL - ксилола и толуола; САМ - камфары, NAH - нафталина. Плазмиды САМ и NAH сами способствуют своему переносу, стимулируя спаривание бактерий [2].

В результате последовательных скрещиваний был получен «суперштамм», несущий плазмиды XYL и NAH и гибридную плазмиду, содержащую части плазмид ОСТ и САМ. Такая мультиплазмидная бактерия растет, утилизируя неочищенную нефть. Однако возможность эффективного применения такого организма в естественных условиях требует доказательства [2].

Рис. 6. Суперштамм, полученный на основе последовательных скрещиваний четырех штаммов Pseudomonas putida. Штамм содержит XYL и NAH плазмиды, гибридную САМ/ОСТ, т.к. изолированные плазмиды Сам и ОСТ не способны существовать в одной клетке

Использование методов генетического конструирования микробных штаммов-деструкторов ксенобиотиков для практического применения находится на ранней стадии. Одна из основных проблем при конструировании микроорганизмов на основе природных катаболических плазмид -стабильность. Стабильность систем «хозяин-вектор» особенно важна при интродукции штаммов в естественную среду. При возвращении микроорганизма с новой катаболической функцией в исходную природную среду ему приходится конкурировать с хорошо адаптированной к данным условиям среды естественной микрофлорой, сталкиваться с огромным разнообразием источников углерода, в том числе высокотоксичных. При этом совершенно неясны перспективы сохранения стабильности новой катаболической функции и, следовательно, самого штамма [2].

Пока существует большой разрыв между достижениями, полученными в конструировании микроорганизмов, и возможностями их практического применения. Вероятно, в будущем наиболее перспективными для детоксикации ксенобиотиков будут биологические системы, состоящие из микробиологической консорции индивидуальных организмов и микробных сообществ, полученных методами клеточной и генетической инженерии [4].

Таким образом, природные генетические механизмы обмена информации позволяют получать эффективные штаммы-деструкторы ксенобиотиков. Это тем более важно, так как общепринятые методы работы с рекомбинантными ДНК, применяемые для клонирования чужеродной ДНК с небольшим числом генов, имеют существенные ограничения при клонировании метаболических путей деградации ксенобитиков, кодируемых десятками генов. Ограничения также обусловлены недостатком знаний о механизмах деградации и структуре метаболических путей, а также возможностями риска, связанного с попаданием сконструированных организмов в среду. Методы генетической инженерии могут быть полезными для усовершенствования уже существующих деградативных способностей микробных клеток [2].

3. МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ПУТИ БИОДЕГРАДАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ, СОЗДАННЫЕ МЕТОДАМИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ

Некоторые микроорганизмы обладают природной способностью к деградации различных ксенобиотиков, однако следует иметь в виду, что:

1) ни один из них не может разрушать все органические соединения;

2) некоторые органические соединения в высокой концентрации подавляют функционирование или рост деградирующих их микроорганизмов;

3) большинство очагов загрязнения содержит смесь химикатов, и микроорганизм, способный разрушать один или несколько ее компонентов, может инактивироваться другими компонентами;

4) многие неполярные соединения адсорбируются частицами почвы и становятся менее доступными;

5) биодеградация органических соединений часто происходит довольно медленно. Часть этих проблем можно решить, осуществив конъюгационный перенос плазмид, которые кодируют ферменты разных катаболических путей, в один реципиентный штамм (рис.7). Если две плазмиды содержат гомологичные участки, то между ними может про изойти рекомбинация с образованием гибридной плазмиды, которая имеет больший размер и обладает свойствами исходных плазмид. Если же две плазмиды не содержат гомологичных участков и относятся к разным группам несовместимости, то они могут сосуществовать в одной бактерии [5].

Рис. 7. Создание бактериального штамма, способного разрушать камфару, октан, ксилол и нафталин. Штамм А, несущий плазмиду САМ (она детерминирует разрушение камфары), скрещивают со штаммом В, несущим плазмиду ОСТ (разрушение октана). При этом образуется штамм Е, который содержит гибридную плазмиду, образовавшуюся в результате гомологической рекомбинации между исходными плазмидами и обладающую функциями каждой из них. Штамм С, содержащий плазмиду XYL (разрушение ксилола), скрещивают со штаммом D, содержащим плазмиду NAH (разрушение нафталина), и получают штамм F, который несет обе плазмиды. Наконец, скрещивают штаммы Е и F, в результате чего образуется штамм G, содержащий плазмиды САМ/ОСТ, XYL и NAH.

3.1. Перенос плазмид

Большинство разрушающих ксенобиотики бактерий, модифицированных путем переноса плазмид, являются мезофильными микроорганизмами (хорошо растут при 20-40⁰С), а температура воды в загрязненных реках, озерах и океанах обычно лежит в диапазоне от 0 до 20⁰С. Чтобы проверить, можно ли создать бактерию, обладающую более широкими катаболическими возможностями и в то же время способную расти и развиваться при низких температурах, плазмиду TOL (детерминирует разрушение толуола) мезофильного штамма Pseudomonas putida перенесли с помощью конъюгации в психрофильный (с низким температурным оптимумом) штамм, утилизирующий салицилат при температуре, близко к 0^0С. Трансформированный штамм содержал введенную в него плазмиду TOL и собственную плазмиду SAL, детерминирующую разрушение салицилата, и был способен утилизировать как салицилат, так и толуол в качестве единственного источника углерода при ОХ. Психрофильный штамм дикого типа (нетрансформированный) не мог расти при любой температуре, если единственным источником углерода, был толуол (толуат). Эта работа показала принципиальную возможность создания психрофильных штаммов бактерий, эффективно разрушающих ксенобиотики в природных условиях, но для их реального получения необходимо провести дополнительные исследования [5].