Кинетические методы определения загрязнителей в различных природных средах (стр. 3 из 7)

Избирательность индикаторных реакций характеризуется максимально допустимым содержанием посторонних ионов, при которых относительная погрешность определения анализируемого вещества не превышает заданного значения, например, 0,1.

Кислотность раствора влияет на избирательность определения, если в лимитирующей стадии индикаторной реакции участвует ион водорода, а также в случае образования в результате гидролиза при разных значениях рН гидроксокомплексов, обладающих различной каталитической активностью. Так, каталитически активные комплексы Ti образуются при рН = 3,8, а максимальное содержание каталитически активных

наблюдается при рН = 1,1 и pH = 2,2, соответственно.

Для устранения мешающего влияния посторонних компонентов применяют традиционные для аналитической химии приемы отделения или маскирования мешающих примесей.

Кинетические методы (в том числе и ферментативные) при условии строгого соблюдения условий проведения анализа не уступают другим методам по точности, достаточно экспрессны, легко поддаются автоматизации. В практике аналитической химии эти методы применяют:

· при анализе смесей близких по свойствам органических соединений (некаталитический вариант);

· при определении микроколичеств ионов 3d-элементов, группы платиновых металлов, ряда анионов (I , Cl , Br ) и органических веществ в природных и промышленных объектах;

· при определении присутствия токсичных и лекарственных препаратов, физиологически активных соединений в биологических объектах и объектах окружающей среды (ферментативные методы).

ГЛАВА 2. НЕКОТОРЫЕ ОСНОВНЫЕ СВЕДЕНИЯ О ФЕРМЕНТАХ

Ферменты - биологические катализаторы белковой природы, ускоряющие химические реакции в живых организмах и вне их. Ферменты обладают уникальными свойствами, которые выделяют их на фоне обычных органических катализаторов гомогенного типа. Прежде всего это необычайно высокая каталитическая активность. Так, добавка незначительной концентрации фермента (10- 9-10- 7 М) ускоряет превращение субстрата в 108-1012 раз. Другое, не менее важное свойство ферментов - специфичность (избирательность) их действия в отношении структуры субстрата, типа реакции и условий ее проведения. Специфичность определяется способностью фермента превращать только данный тип субстратов в определенных реакциях и условиях. Эти свойства ферментов обусловлены сложной структурой макромолекул белка и весьма сложным механизмом их действия.

Превращение субстрата происходит на активном центре фермента. Для многих ферментов, состоящих из субъединиц, характерно наличие регуляторного участка, который взаимодействует с веществами, влияющими на активность фермента, - активаторами, ингибиторами или инактиваторами (рис. 4).

Важным свойством ферментов, которое необходимо учитывать при их практическом использовании, является стабильность, то есть способность сохранять каталитическую активность. При хранении и особенно в ходе ферментативной реакции фермент может частично или полностью терять свою каталитическую активность, другими словами, инактивироваться. Одним из эффективных способов стабилизации ферментов является их иммобилизация - перевод в водонерастворимое состояние путем связывания с носителем или модифицирование водорастворимыми полимерами с полным или частичным сохранением ферментами каталитической активности. Повышение стабильности и возможность многократного использования иммобилизованных ферментов значительно повышают экономичность ферментативных методов анализа.

2. 1. Возможности ферментативных методов анализа

Пределы обнаружения веществ, определяемых ферментативными методами (субстратов, активаторов, обратимых и необратимых ингибиторов и инактиваторов ферментов) зависят не только от каталитической активности фермента, но и от других кинетических характеристик используемой индикаторной реакции. Фермент катализирует реакции, в которых участвуют, как правило, один или два субстрата. Простейшая односубстратная реакция описывается обычно схемой Михаэлиса-Ментен

E + S ES P + E,

где Е - фермент, S - субстрат, ES - промежуточный комплекс фермента с субстратом (комплекс Михаэлиса-Ментен), Р - продукт. Концентрация субстрата [S]0 будет пропорциональна u0 только при условии, когда [S]0 ! Km . Тогда

[S]0 = u0Km / kкат[E]

Следовательно, верхняя граница определяемых концентраций субстрата ограничена величиной константы Михаэлиса-Ментен (Km). Нижняя граница определяемых концентраций субстрата определяется той величиной u0 , которая может быть зафиксирована с помощью используемого для наблюдения инструментального метода, причем величина u0 тем выше для одного и того же значения [S]0 , чем выше kкат и [E]. Таким образом, использование высокоактивного фермента (большое значение kкат) и повышение его концентрации в реакционной смеси могут существенно снизить предел обнаружения субстрата.

Несколько другие кинетические закономерности следует учитывать при определении тех веществ, которые являются эффекторами ферментов.

Для контроля начальной скорости ферментативного процесса или концентрации продукта реакции могут быть использованы практически любые доступные исследователю физико-химические методы. Наиболее часто применяют фотометрические методы индикации. При этом в качестве индикаторных часто используют, например, катализируемые пероксидазой и другими оксидазами (ферментами, катализирующими окислительно-восстановительные реакции), а также гидролазами (катализирующими реакции гидролиза) реакции образования окрашенных продуктов. Исключительно высокой чувствительностью отличаются хемилюминесцентные методы, позволяющие контролировать скорость ферментативных реакций с участием, например, люциферазы. Различные электрохимические методы (потенциометрия, амперометрия) наиболее удобны для контроля скорости реакций, протекающих с поглощением или выделением протонов, а также окислительно-восстановительных процессов, сопровождающихся поглощением кислорода, образованием Н

и т.д. Ферментные электроды, в которых фермент механически или ковалентно включают в полупроницаемую полимерную мембрану, покрывающую электрод, позволяют специфически определять различные органические и неорганические соединения без введения в анализируемый раствор дополнительных реагентов.

К настоящему времени разработано большое число высокочувствительных и селективных ферментативных методов определения субстратов и эффекторов ферментов: неорганических (ионов металлов, анионов) и органических (N-, S-, P-, O-содержащих) соединений. При этом можно выделить ферменты, позволяющие определять целый класс соединений, либо часть этого класса, либо индивидуальное соединение. Так, с помощью алкогольдегидрогеназы можно определять спирты (субстраты этого фермента), алкогольоксидазы - первичные спирты, арилалкогольоксидазы - ароматические первичные спирты. Следует отметить, что методы определения эффекторов, хотя и менее селективны, часто более чувствительны, чем методы определения субстратов. Так, пределы обнаружения многих органических веществ - субстратов ферментов лежат в интервале 10- 6-10- 4 М, а органических эффекторов - 10-11-10- 8 М. Кроме того, число эффекторов ферментов значительно больше, чем число их субстратов, что расширяет возможности ферментативных методов анализа.

2. 2. Определение органических соединений

Ферментативные методы определения органических соединений успешно разрабатываются и применяются в клинических и биохимических лабораториях. Именно применение ферментов дает возможность селективно определять в крови, моче, тканях и других биологических объектах малые количества таких метаболитов и физиологически активных веществ, как мочевина, мочевая кислота, аминокислоты, сахара (в частности, глюкоза), спирты, липиды, холестерин, нуклеотиды, антибиотики.

Ферментативное определение мочевины основано на реакции ее гидролиза, катализируемой ферментом уреазой. Образующиеся продукты гидролиза - ионы и можно определять электрохимически, фотометрически или флуориметрически. Групповое определение аминокислот основано на использовании таких ферментов, как L-амино- или D-аминооксидаза, которые катализируют окисление аминокислоты кислородом воздуха до кетокислоты, пероксида водорода и аммиака. Последний далее определяют электрохимически с помощью NH3-чувствительного газового электрода. Специфическое определение отдельных аминокислот возможно при применении декарбоксилаз, дегидрогеназ, лиаз, трансфераз. Для определения глюкозы используют несколько специфических ферментативных реакций, например: 1) катализируемое глюкозооксидазой окисление ее кислородом воздуха (или другими окислителями) до глюконовой кислоты и пероксида водорода; 2) ее взаимодействие с АТФ с образованием глюкозо-6-фосфата в присутствии гексокиназы. При использовании первой реакции определение глюкозы проводят либо наблюдая за уменьшением количества кислорода в растворе с помощью О2-чувствительного электрода Кларка, либо измеряя рН раствора, который изменяется вследствие образования глюконовой кислоты, либо определяя количество образовавшегося пероксида водорода. Ферментативные методы определения сахарозы и других дисахаридов основаны на использовании специфических ферментов (инвертазы, лактазы), превращающих дисахариды в моносахариды, одним из которых является глюкоза. Далее глюкозу определяют с помощью описанного выше метода. Ферментативное определение этанола основано на использовании одного из двух ферментов: алкогольоксидазы, катализирующей окисление этанола кислородом воздуха до ацетальдегида и Н2О2 , или алкогольдегидрогеназы, в присутствии которой спирт в реакции с НАД (никотинамидадениндинуклеотидом) превращается в НАД " Н2 .