Количественный анализ силибина в экстрактах, полученных с использованием субкритической воды (стр. 5 из 6)
Приготовление подвижной фазы
Для проведения измерений методом ВЭЖХ готовили смесь ацетонитрила с 0,01М раствором фосфатного буфера в объемном соотношении 35:65. Требуемые объемы ацетонитрила и фосфатного буферного раствора отмеряли мерными цилиндрами.
Для приготовления подвижной фазы использовали ацетонитрил «extra pure» фирмы «MERCK».
Приготовление раствора фосфатного буфера.
0,1М раствор фосфатного буфера готовился путем растворения 13,8 г натрия фосфорнокислого (NaH2PO4·H2O) в 900 см3 бидистиллированной воды, раствор тщательно перемешивали и доводили до 1000 см3. Затем 100 см3 полученного 0,1М буферного раствора разбавляли водой до 1000 см3 и добавляли 2М раствор соляной кислоты до рН=3.
Готовую подвижную фазу дегазировали гелием.
Режим работы хроматографа для определения времени удерживания исследуемых компонентов:
· Температура колонки25оС;
· Скорость потока0,6 мл/мин;
· Объем вводимой пробы20 мкл;
· Длина волны 289 нм
· Время анализа 20 мин.
Качественный анализ компонентного состава экстрактов проводили по временам удерживания БАС относительно времени удерживания стандартного образца сравнения (силибина) с использованием литературных данных [20, 21].
Количественный анализ силибина проводили методом абсолютной градуировки.
Приготовление градуировочных смесей
Построение градуировочных характеристик (зависимость площади хроматографического пика вещества от его концентрации) осуществляли с использованием государственного стандартного образца (ГСО) силибина (рег. №42-0072-01).
Для приготовления градуировочных растворов силибина 0,02 г ГСО силибина растворяли в мерной колбе вместимостью 100 мл в 80 мл 95%-ного этилового спирта при нагревании (Т=70°С), затем содержимое колбы охлаждали и доводили объем раствора до метки. Далее объемно-весовым методом готовили серию градуировочных растворов силибина в этаноле (0,5 – 50 мг/дм3).
Значения концентраций таксифолина, силикристина и силидианина рассчитывали методом внутреннего стандарта по уравнению:
,(1)где
- площадь хроматографического пика определяемого компонента; 
- площадь хроматографического пика стандарта (силибина); 
- концентрация стандарта.Коэффициенты чувствительности для исследуемых компонентов относительно стандартного вещества силибина равны единице, так как все они имеют одинаковое поглощение при длине волны спектрофотометрического детектора
= 289 нм [1].Построение градуировочных зависимостей
По полученным результатам пяти параллельных измерений для каждого градуировочного раствора стандарта (силибина) были построены градуировочные характеристики, описываемые уравнением
,(2)где
и - входной и выходной сигналы хроматографа соответственно, ‑концентрация компонента в градуировочной смеси; – площадь хроматографического пика; 
- константа корреляционного уравнения, рассчитываемая методом наименьших квадратов [20]: 
,(3)где m=5 –количество градуировочных растворов;
в растворе.2.7 Оценка погрешностей измерения определяемых величин
По результатам анализа градуировочных растворов силибина проведена оценка правильности и прецизионности измерения [22]. Для этого рассчитывали абсолютный коэффициент чувствительности для расчета концентрации силибина в исследуемых смесях:
,(4)где
- измеренная концентрация силибина в i-ом градуировочном растворе, 
- абсолютный коэффициент чувствительности для силибина или тангенс угла наклона зависимости 
.1. Правильность измерения,
(%) в каждой выборке определяли по уравнению 
(5)где
- среднее значение измеренной концентрации в i-ом градуировочном растворе, - истинная концентрация силибина в градуировочном растворе.2. Прецизионность измерения:
- Среднее квадратичное отклонение единичного измерения концентрации в i-ой выборке:
,(6)где n=5 – число измерений в выборке.
- Граница доверительного интервала измерений для i-го градуировочного раствора:
,(7)где
- критерий Стьюдента при доверительной вероятности P=0,95 и числе степеней свободы f=n-1.- Предел прецизионности riв условиях повторяемости для двух измерений:
,(8)где 1,96 – коэффициент критического диапазона при Р=0,95.
- Относительное среднее квадратическое отклонение (ОСКО) среднего арифметического результата измерения
(%) в выборке: 
(9)В таблице 1 приведены показатели точности измерения концентрации силибина в градуировочных растворах.
Таблица 1. Показатели точности определения концентрации силибина
Истинная концен-трация  ,мг/дм3 | Измерен-ная концентра-ция , мг/дм3 | Разность двух концентраций в выборке  , мг/дм3 | Предел прецизион-ностиri, мг/дм3 | Граница доверительного интервала  , мг/дм3 | Правиль-ность измере-ния  ,% | ОСКО ,% |
| 0,50 | 0,45 | 0,09 | 0,10 | 0,05 | 10,00 | 3,70 |
| 1,00 | 0,89 | 0,14 | 0,20 | 0,08 | 11,00 | 3,00 |
| 5,00 | 4,66 | 0,76 | 0,80 | 0,39 | 6,80 | 2,80 |
| 10,00 | 9,48 | 1,77 | 1,90 | 0,89 | 5,20 | 3,20 |
| 50,00 | 45,84 | 6,50 | 7,70 | 3,75 | 8,30 | 2,70 |
Как видно из данных таблицы 1, разность двух измеренных концентраций силибина (максимальной и минимальной) для всех градуировочных растворов не превышает предела прецизионности ri,,а общая погрешность измерения концентрации силибина с учётом правильности и прецизионности может быть принята на уровне
относительно измеряемой концентрации.3. Обсуждение результатов
Создание и производство лекарственного препарата, как на основе синтезированных форм, так и на основе лекарственных растений – задача сложная. Наряду с технологическими и производственными задачами в первую очередь возникают проблемы, связанные с получением фармацевтических субстанций с особой химической чистотой, качеством и терапевтической эффективностью. В то же время лекарственные формы должны отвечать определенным требованиям, одним из которых является растворимость. Очевидно, что размер частиц определяет размеры поверхности, которые в свою очередь контролируют скорость растворения и действие лекарства. Микро- и наноформы фармпрепаратов обладают уникальными свойствами и преимуществами, открывающими новые перспективные подходы к терапии самых различных заболеваний. Прежде всего, микронизация позволяет существенно повысить скорость растворения гидрофобных фармпрепаратов в водных средах. Также известно, что для достижения терапевтического эффекта малорастворимые в водной среде лекарственные препараты должны применяться в высоких дозах, что обусловливает их нежелательное побочное действие, представляющее серьезную проблему в случае сильнодействующих противоопухолевых, гормональных, противовоспалительных, противогрибковых препаратов и антибиотиков.