3) десатурація бічного ланцюга з утворенням С-22(23) подвійного зв’язку;
4) ізомеризація ∆8∆7;
5) дегідрування з утворенням ∆5;
6) відновлення 24(28) метиленової групи до метильної [1].
1.4 Умови утворення ергостерину дріжджами
Найбільш високу кількість стеринів синтезують штами Saccharomycescarlsbergensis. Їх біомаса може містити більш ніж 10 % ергостерину.
Важливою умовою синтезу ергостерину дріжджами є достатнє аерування. В анаеробних умовах в клітинах дріжджів накопичується попередник ергостерину – сквален. Доведено, що кисень індукує синтез стеринів, надаючи активуючу дію на епоксидазу сквалену – перший фермент біосинтетичного шляху. Індукція синтезу ергостерину починається за 0,03 %-го вмісту кисню в газовій фазі і досягає максимуму за 2 %-ї концентрації.
Для біосинтезу стеринів є важливим, щоб середовище містило великий надлишок вуглеводів і мало азоту. Дріжджі багаті на білок, як правило, містять мало стеринів. Ці дані, головним чином, стосуються пекарських дріжджів. У випадку дріжджів роду Candida високе співвідношення C/N в середовищі призводить до накопичення ліпідів, а не ергостерину.
Н-алкани, якщо вони можуть споживатись дріжджами, являються найкращим джерелом вуглецю для синтезу ергостерину, аніж вуглеводи. Можливо, це пов’язано з утворенням із алканів ацетату (попередника ергостерину) в результаті β-окиснення алканів. Для пекарських дріжджів ацетат також являється гарним джерелом вуглецю в біосинтезі стеринів.
Стимулюючу дію на утворення стеринів дріжджами спричиняють інгібітори гліколізу та роз’єднувачі окисного фосфорилювання і дихання, а також забезпеченість дріжджів вітамінами і, перш за все, пантотеновою кислотою, яка у складі КоА бере участь у побудові молекули ергостерину.
Під час дії на дріжджі рентгенівського випромінювання вміст ергостерину збільшується в 2 – 3 рази, що пояснюється пригніченням процесу амінування, який супроводжується підвищеним синтезом ліпідів. Подібно до іонізуючого випромінювання діють радіоміметричні речовини, порушуючи метаболізм клітини і стимулюючи ліпідний обмін. Наприклад, під час комбінованої дії на клітини дріжджів радіоміметричної речовини (ембіхіну) і рентгенівського випромінювання вихід стеринів Sacch. cerevisiae збільшується на 109 % по відношенню до контролю.
Полієнові антибіотики ністатин і філіпін, взаємодіючи з мембраною дріжджів, підвищує рівень стеринів на 50 – 60 % по відношенню до контролю.
Синтез стеринів не пов’язаний із ростом дріжджів. Вміст стеринів підвищується по мірі старіння культури і стериноутворення продовжуються після зупинки росту дріжджів.
Роль стеринів в метаболізмі продуцентів не зовсім зрозуміла. Спостерігається зв’язок між дихальною активністю дріжджів і утворенням ергостерину. В анаеробних умовах дріжджі містять багато сквалену і мало ергостерину. Роль ергостерину, як структурного компоненту мембран, пов’язують із проникністю клітинних мембран дріжджів.
Найбільш збагачена стеринами у дріжджів фракція мітохондрій. Вірогідно, що мітохондрії беруть участь у біосинтезі стеринів, а стерини, в свою чергу, приймають участь в утворенні мітохондріальних структур і впливають на їхню функціональну активність.
Стерини містять в молекулі ОН-групу і в клітині значною мірою присутні як ефіри жирних кислот. Тому існує твердження, що утворення стеринів – це реакція детоксикації, що захищає організм від надлишкової продукції жирних кислот. Стерини використовуються для транспорту ненасичених кислот і, можливо, інших сполук в клітині. Мікоплазми включають стерини клітинні мембрани. Дріжджі Sacch. cerevisiae в умовах низького вмісту розчиненого кисню в середовищі поглинають екзогенні стерини, при цьому частина їх піддається трансформуванню із утворенням комерційно вигідних стероїдів. Наприклад, десмостерин дріжджі перетворюють в 24 β-метилхолестерин, а 24,25-дигідроланостерин – в 7-дегідрохолестерин, який є інтермедіатом під час синтезу вітаміну D3[1].
2. Технологія біосинтезу ергостерину
2.1 Технологічні аспекти отримання ергостерину
В промисловості ергостерин отримують, використовуючи дріжджі Sacch. cerevisiae, Sacch. carlsbergensis, а також міцеліальні гриби. Засів проводять великою кількістю інокуляту. Культивування проводять за високої температури і сильного аерування середовища, що містить великий надлишок джерел вуглецю по відношенню до джерела азоту.
Максимум поглинання ергостерину знаходиться за довжини хвилі світла 280 нм. Саме це випромінювання збуджує окремі зв’язки кілець А і В в молекулі ергостерину і викликає його перетворення у вітамін D2. Опромінення проводять ультрафіолетовими лампами із довжиною хвилі 280 – 300 нм. Опромінюють або сухі дріжджі, або тонкий шар їхньої 5 %-ї суспензії. Під впливом більш коротко- або довгохвильових випромінювань збільшується вихід інших сполук стеринової природи.
На вихід вітаміну D2 (і утворення інших сполук) впливають тривалість опромінення, температура, наявність домішок. Тому опромінення ергостерину, що використовується в якості харчових добавок, проводять з більшою обережністю.
Провітамін D2 отримують із маси, що залишається після фільтрування культуральної рідини. Біомасу промивають, висушують, розмелюють і двічі оброблюють за 78 °С трикратним об’ємом спирту.
Спиртові екстракти згущують до 70 %-го вмісту сухих речовин. Таким чином отримують ліпідний концентрат. Його омилюють розчином гідроксиду натрію, стерини залишаються в неомиленій фракції. Кристали ергостерину випадають із розчину за 0 °С. Очищення кристалів проводять шляхом перекристалізації, послідовним промиванням 69 %-м етиловим спиртом, сумішшю етилового спирту і бензолу (4:1) і повторним перекристалізуванням. Отримані кристали ергостерину висушують, розчиняють в ефірі і опромінюють, Після цього ефір випаровують, а розчин вітаміну концентрують і кристалізують.
Для отримання олійного концентрату розчин вітаміну після фільтрування розводять олією до стандартного рівня.
Джерелом отримання ергостерину також може слугувати міцелій грибів, що залишається як відхід антибіотичної промисловості і виробництва лимонної кислоти [1].
Крім провітаміну D (ергостерину) в дріжджах містяться вітаміни групи В: В3, В6, Н, Вс, холін, інозит, р-амінобензойна кислота. За виключенням ергостерину, що розчинний в жирах, всі інші вітаміни, що містяться в дріжджах розчиняються у воді. В дріжджах також містяться фосфоліпіди, ферменти і нуклеїнові кислоти. Відповідно, раціональна технологічна схема переробки дріжджів повинна базуватися на процесах, що забезпечують повну екстракція вітамінів, що містяться у дріжджах, та збереження дріжджового білку.
Проте, екстрагування із дріжджів ергостерину та водорозчинних вітамінів пов’язано із значними складнощами, оскільки вітаміни міцно зв’язані із білковою частиною дріжджової клітини. Тож для вилучення вітамінів необхідно руйнувати білкові комплекси клітин, що може здійснюватися різними методами, зокрема гідролізом або автолізом дріжджової біомаси.
Гідроліз білку може здійснюватись шляхом нагрівання і кип’ятіння дріжджів, розведених і підкислених молочною або соляною кислотою до рН 5, під невеликим тиском в автоклаві. За допомогою цього методу можливим є комплексне використання дріжджів з отриманням концентрату вітамінів групи В, кристалічного ергостерину і білкової кормової сировини.
За методом ферментативного гідролізу дріжджову біомасу піддають автолізу за температури 45 °С. В процесі автолізу фермент, що міститься в дріжджах, руйнує білкові речовини протоплазми, звільнюючи вітаміни, що входять в їх склад.
Автолізовані або гідролізовані дріжджі обробляють спиртом для вилучення вітамінів групи В і для забезпечення належної здатності до фільтрації. Спиртом або іншим розчинником екстрагують стерини, а дріжджовий шріт після вилучення спирту використовують як кормовий продукт.
Для зневоднення дріжджових клітин та коагуляції білку біомасу обробляють спиртом. Дріжджові клітини стають щільними, легко осідають на дно і добре фільтруються.
Тож, для максимального вилучення вітамінів і використання цінних поживних властивостей дріжджового шроту, технологічну схему варто будувати наступним чином:
1. Для вилучення вітамінів, міцно зв’язаних із білково-ферментними комплексами, і збільшення таким чином їхнього виходу, необхідно піддавати дріжджі гідролізу і автолізу.
2. Для забезпечення належної консистенції необхідно автолізовану (гідролізовану) дріжджову масу піддавати обробці спиртом з екстракцією водорозчинних вітамінів групи В.
3. Для вилучення стеринів і фосфоліпідів висушений дріжджовий шріт варто піддавати додатковій обробці спиртом або іншим розчинником.
4. Отриманий після екстракції стеринів та видалення спирту білково-дріжджовий шріт можна використовувати для харчових або кормових цілей, а також для отримання нуклеїнових кислот [2].
2.2 Накопичення біомаси дріжджів
Приготування поживного середовища. Середовище повинне відповідати певним вимогам:
а) забезпечувати максимальний приріст біомаси;
б) складатися з відносно дешевих компонентів;
в) мати гарну фільтруючу здатність;
Найбільш оптимальним субстратом для накопичення біомаси дріжджів у процесі отримання ергостерину є н-алкани, оскільки вони сприяють максимальному виходу цільового продукту. Під час використання н-алканів проблема складу поживного середовища являється особливо актуальною, оскільки макро- та мікроелементи відсутні у вихідній сировині. За загальноприйнятою схемою в розчин макроелементів вносять наступні солі: сульфат амонію (~1,5 кг/м3) та хлорид натрію (~0,9 кг/м3). Розчин мікроелементів готується окремо і складається із ряду сульфатів, що являються джерелом таких речовин, як магній, манган, залізо, цинк, мідь, натрій. Крім того, для підтримки постійного значення рН, що знижується в процесі культивування, в ферментер подається аміачна вода, яка одночасно є додатковим джерелом азоту [3].