Конструирование биосенсора для регистрации P. aeruginosa АТСС 27853 (стр. 1 из 6)
ВЫПУСКНАЯ РАБОТА
БАКАЛАВРА ПРИКЛАДНОЙ ФИЗИКИ
Конструирование биосенсора для регистрации P. aeruginosa АТСС 27853
СОДЕРЖАНИЕ
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
РАЗДЕЛ 1. Биосенсоры
1.1Механизмы, которые обеспечивают селективность и выборочность биосенсоров
1.2Биосенсоры - принципы конструирования
1.3Применение биосенсоров
РАЗДЕЛ 2. Материалы и методы
2.1 Автоматический вычислительно-измерительный компьютеризированный комплекс для исследования биоэлектрохимических межфазных границ
2.2 Электрохимическая ячейка
2.3 Электроды
2.4 Очистка и подготовка растворов
2.5 Стратегия создания биосенсора для регистрации P.AERUGINOSA АТСС 27853
РАЗДЕЛ 3. Результаты исследований
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
ITO – оксид индия
Red–ox – окислительно - восстановительная реакция
ЦВАЗ - циклическая вольтамперная зависимость
АСКМ – антиген сыворотки крови мышей
ДЭС – двойной электрический слой
ВВЕДЕНИЕ
Регистрация патогенных микроорганизмов в растворах электролитов является одним из основных заданий медицины, биохимии и электрохимического анализа. С этой целью в мире разрабатываются биосенсорные устройства, которые дают возможность достаточно быстро и избирательно регистрировать патогенные штаммы микроорганизмов. Для этого используют потенциометрию, амперометрию и другие электрохимические методы. Важным элементом биосенсора является ионпроводящая мембрана, содержащая биологически активные компоненты. Синтез высоко проводящих наноразмерных по третьей координате полимерных платформ, структур, пленок или мембран для конструирования биосенсоров реализуют различными способами. В зависимости от поставленной задачи используют твердотельные ионообменные мембраны [1], электрохимически синтезируемые полимерные платформы [2, 13], электрохимическую самосборку полимолекулярных слоев с использованием α,ω–тиольного компоновщика [2,3]. Разработка и внедрение в медицинскую практику новых биосенсоров отечественного производства на основе недорогих отечественных комплектующих с использованием их для регистрации сигнала импеданса, фарадеевской емкости, поляризационного сопротивления, тока, стохастических спектральных шумовых или электромагнитных сигналов межфазной границы электрод/биообъект является задачей чрезвычайно актуальной и своевременной.
РАЗДЕЛ 1. Биосенсоры
1.1 Механизмы, которые обеспечивают селективность и выборочность биосенсоров
Рассмотрим три типа биосенсоров - спектроэлектрохимический, ферментативный амперометрический и резистометрический (кондуктометрический). Биосенсоры - разновидность химических сенсоров - часто обладают отличной селективностью благодаря специфичности биологических реакций, но в них есть недостаток - малый срок службы. Применение химически селективных мембран в известной мере снижает посторонние препятствия. Увеличение селективности к определенному анализируемому раствору или классу таких растворов достигается путем использования спектроэлектрохимии химически селективных пленок [4], которые наносят на поверхность электрода. В этом случае для определения агента последний должен быть: 1) распределятся в пленке, которая обладает химической выборочностью; 2) окисляться или восстанавливаться на поверхности электрода при заданном потенциале; 3) его окисленная или восстановленная форма должна поглощать свет некоторой заданной длинны волны, используемой для определения. На рисунке 1 показана схема, которая демонстрирует работу спектроелектрохимического биосенсора.
Рисунок 1. Схема оптоэлектрохимического биосенсора. Обозначение: (Ä- вещества, которые проникают в пленку; Æ – вещества, которые проникают в пленку, но не поддаются Red–ox превращениям; o – вещества, которые проникают в пленку и поддаются Red–ox превращениям и дают сигнал, но не на "аналитической" длине волны; ► – вещества, которые проникают в пленку и поддаются Red–ox превращениям, продукты которых дают сигнал на "аналитической" длине волны).
На правую боковую стенку волновода нанесена тонкая пленка оксида индия (ITO), которая представляет собой оптически прозрачную поверхность. На нее наноситься тонкая мешка ионселективной пленки, которая обладает химической выборочностью. Свет, который проходит по оптическому волноводу в каждой точке, где происходит отражение, вызывает исчезающе слабое поле, которое проникает в пленку. Взаимодействие этого поля с анализируемым веществом в пленке приводе к затуханию света, который проходит по волноводу. Оно связано с концентрацией анализируемого вещества в пленке, которая выполняет две важных функции:
1 - она предварительно концентрирует анализируемое вещество вблизи поверхности электрода, и может быть определена спектроэлектрохимически в режиме нарушенного полного внутреннего отражения;
2 - она способствует устранению препятствий со стороны других веществ, поскольку слабое поле проникает на такую малую глубину, что оптический "пробник" касается только того вещества, которое находится в середине пленки. На практике анализируемое вещество, распределенное в пленке, можно зарегистрировать лишь в случае если оно вступает в Red–ox реакцию на поверхности электрода, что приводит к поглощению света на "аналитической длине волны". Его модулируют путем электрохимического циклирования между поглощающими и не поглощающими состояниями вещества. Рассмотрим работу ферментативного биосенсора [5]. На рисунке 2 показана схема генерации сигнала при ферментативном катализе, который используется для регистрации микробиологического субстрата.
Рисунок 2. Схема генерации сигнала в амперометрическом ферментативном электроде, где Ф - фермент, М - медиатор, С - субстрат, П - продукт.
Фермент состоит из одной или больше пептидных цепей, которые образуют третичную структуру, стабилизированную электростатическими взаимодействиями, водородной связью и дисульфидными мостиками. Его каталитическая активность связана с активным центром, где идет реакция. Она специфическая в силу уникальной пространственной конфигурации и заряда этого центра. Ферменты реагируют с субстратом по следующей схеме:
E + S
ES 
P + E, (1)где: Е - фермент, S - субстрат фермента и Р - продукт ферментативной реакции. Кинетика этого процесса детально проанализирована Михаелисом - Ментеи [6]. Скорость образования или исчезновения продукта описывается следующим уравнением:
–(dS/dP) = (dP/dt) = (ks[E][S])/([(k2 + k3)/k1] + [S]) = (Vmax[S])/(Km + [S]), (2)
где: Vmax – максимальная скорость ферментативной реакции, Km – константа Михаелиса. При инверсии уравнения (2) оно позволяет получить зависимость Ханеса:
(1/V) = (Km/Vmax[S]) + (1/Vmax). (3)
Эти уравнения позволяют определить концентрацию количества субстрата, или количества фермента, которые участвуют в каталитической реакции.
В ферментативных амперометрических биосенсорах обычно измеряется скорость поглощения кислорода или разряда ферментативной реакции, которая нарабатывается в ходе реакций:
лецитин + Н2Про
холин + фосфористая кислота, (4)холин + ПРО2 + 2Н2Про
бетаин + 2Н2ПРО2 , (5)где: ChOx -фермент холиноксидаза.
Иммобилизация ферментов необходима для того, чтобы увеличить стабильность измерений, сделать более эффективную связь ферментативной реакции с преобразователем, локализировать реакцию в одном сенсоре, сделать возможными непрерывные измерения и доступным их математический анализ.
Иммобилизацию ферментов проводят ионообменом или ковалентным связыванием, поперечной сшивкой (сетка) или удерживанием в ловушках (молекулярные решетки, микроинкапсуляция). Ковалентное связывание наиболее эффективно из всех методов сохранения активности и увеличения долговечности ферментов. Достаточно важным является и связывание фермента с мембраной через соответствующие функциональные группировки. Локализация ферментативной реакции - также один из наиболее важных моментов в технологии создания сенсоров. Появилась возможность локализовать ферментативную реакцию там, где это наиболее выгодно: на мембране или непосредственно на электроде, где прямая реакция протекает без диффузионных ограничений. Возможность непрерывных измерений обеспечивается отсутствием необходимости замены фермента, в котором можно регенерировать после окончании реакции. Содержание ферментов в гелях достаточно детально описано для ферментов, встроенных в агарозу. Ферменты специфическим образом познают субстрат, косубстрат, кофактор, активатор и ингибитор. Ферменты способны осуществлять множество превращений с одинаковой эффективностью. Действие ферментов может приводить к мощному увеличению сигнала, который регистрируется. Ферменты могут быть иммобилизированы.
К резистометрическим сенсорам относят биосенсоры, в которых информационный сигнал пропорционален активной составляющей электрохимического импеданса Z на высокой частоте f. При высоких f комплексная диаграмма Арганда вырождается в точку на действительной оси импеданса ReZ и практически равняется сопротивлению раствора Rр. На рисунке 3 приведена схема тонкопленочного резистометрического биосенсора, использованного в работе [7], для определения глюкозы и мочевины путем измерения проводимости G в крови при частоте переменного тока f = 10 кГц.